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目的:构建体外DENV-2感染BHK、Raw264.7细胞模型,探讨白纹伊蚊唾液重组34k-2蛋白(r Alb-34k2)在DENV-2感染BHK、Raw264.7细胞中可能的调控作用。方法:1)利用RTCA技术实时动态检测r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)对BHK和Raw264.7细胞增殖的影响及其对不同MOI的DENV-2感染引发细胞病变效应(CPE)的调控作用;2)利用q RT-PCR法比较不同MOI感染模型下r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)干预组与病毒对照组、热灭活蛋白组、特异性抗体阻断组之间BHK和Raw264.7细胞胞内病毒NS5基因的表达差异;3)检测不同TCID50滴度下DENV-2感染BHK细胞的半数细胞指数时间(CIT50),构建CIT50-TCID50回归方程,并利用该方程检测BHK细胞感染模型中细胞培养上清中的DENV-2滴度;4)利用q RT-PCR法分析r Alb-34k2蛋白(1μg/ml)对感染前后18h内Raw264.7细胞IFN-β/γ、IL-1β、TNF-α、IL-10、CXCL2及CXCL10的m RNA表达差异的影响。结果:1)RTCA结果显示r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)对BHK细胞、Raw264.7细胞的生长无明显影响;2)在DENV-2感染BHK细胞(MOI=0.01、0.005)、Raw264.7细胞(MOI=5、10)时,各浓度r Alb-34k2蛋白干预组均引起相应细胞增殖曲线左移增加,其中以高浓度蛋白干预组(10μg/ml)引起BHK细胞CIT50显著缩短(P<0.05)、Raw264.7细胞最大CI值(CImax)下降、第45小时的CI值(CI45)显著缩短(P<0.05);3)胞内DENV-2 NS5核酸检测显示:在r Alb-34k2蛋白干预后,BHK细胞、Raw264.7细胞早期胞内病毒核酸表达量均较病毒对照组增高;在BHK细胞中,以高浓度蛋白(10μg/ml)干预组升高显著,MOI=1时,分别为对照组的2.68倍(12h,P<0.01)、3.63倍(24h,P<0.01)、1.62倍(48h,P<0.05);MOI=0.5时,为对照组的3.78倍(12h,P<0.01);在Raw264.7细胞中,蛋白干预组(10μg/ml)分别为病毒感染组(MOI=5)的5.2倍(6h,P<0.01)、3.5倍(12h,P<0.05);且灭活r Alb-34k2蛋白组、特异性抗体阻断组均与病毒对照组无差异;4)构建RTCA标准曲线方程为y=-7.007x+75.546(R2=0.9854);检测病毒含量(log TCID50/ml)的有效性和灵敏度比较:RTCA标曲法为4.90±0.05(D2)、6.27±0.15(D3)、5.99±0.17(D4),传统TCID50法为6.48±0.11(D3)、5.63±0.08(D4),两种方法检测的病毒滴度无统计差异(P>0.05),但以RTCA标曲法更为灵敏。在BHK细胞感染模型中:感染第48h蛋白干预组上清中活病毒水平明显低于病毒对照组(P<0.05);5)r Alb-34k2蛋白对感染前后Raw264.7细胞表达IFN-β、IFN-γ、TNF-α无影响;但可能上调感染前Raw264.7细胞IL-10、抑制CXCL10表达;并在感染后可能参与抑制IL-1β、CXCL2表达的过程。结论:1)r Alb-34k2蛋白可促进DENV-2在BHK细胞中早期增殖,并参与调控病毒的释放;2)r Alb-34k2蛋白可促进DENV-2在Raw264.7细胞中早期增殖;3)构建的CIT50-TCID50标准曲线可用于检测DENV-2的病毒滴度且灵敏度较传统TCID50法高。该实验结果为深入探讨白纹伊蚊唾液34k2蛋白在DENV-2感染靶细胞中的生物学效应提供了一定的实验依据。