乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的具有抗菌作用的多肽或蛋白质,具有安全、容易降解、无毒副作用和无耐药性等优点,并且能有效地抑制多种导致食物腐败的革兰氏阳性菌。细菌素天然具有的特性使其在食品、医药和农业等领域具有巨大应用潜力。而双肽类乳酸菌细菌素PlnEF（PlnE和PlnF的混合物）具有广谱抑菌性,更好的热稳定性,在食品工业的应用前景广阔。乳酸菌是长期在发酵食品中利用的食品级微生物,没有内毒素,是安全的食品级表达受体菌。随着依靠Nisin的自诱导机制建立起来的通用且严谨的基因表达系统——NICE系统的发现应用,乳酸菌食品级高效表达系统的构建及应用已成为当下的研究热点。本研究利用乳酸乳球菌NZ9000中存在Nisin调控的基因表达系统（Nisin-Controlled gene Expression,NICE）,高效异源表达双肽乳酸菌细菌素PlnE和PlnF,并建立高效纯化体系,大量制备PlnE和PlnF,研究PlnEF（等摩尔混合）的抑菌活性和作用机制,为PlnEF在食品医药等领域的应用打下基础。具体内容如下:1.重组质粒的构建及转化乳酸乳球菌。根据Lactobacillus plantarum WCFS1全基因组（登录号NC004567.2）中编码PlnE和PlnF的基因序列,在序列两端添加限制性酶切位点EcoR V和Nco I,合成基因序列（利用pUC18质粒上的SmaI平末端插入目的基因,pUC18-plnE 和 pUC18-plnF）。构建重组质粒 pNZ8124-plnE 和pNZ8124-plnF,电击转化至乳酸乳球菌表达菌株NZ9000,获得重组菌株 NZ9000-pNZ8124-plnE 和 NZ9000-pNZ8124-plnF。2.PlnE和PlnF的诱导表达及条件优化。Tricine-SDS-PAGE结果表明:Nisin能成功诱导多肽PlnE和PlnF的表达。再通过改变诱导浓度、诱导温度和诱导时间等条件来确定最佳诱导条件,NZ9000-pNZ8124-plnE 和 NZ9000-pNZ8124-plnF 在诱导剂添加量为 5 ng/mL,诱导温度为30℃,诱导时间约3h时,蛋白表达量最高。3.PlnE和PlnF的分离纯化。重组蛋白分泌表达在胞外发酵上清液,并且是带有正电荷的疏水性小肽。针对这些特性设计了分离纯化三步法:①发酵上清液经XAD-2大孔树脂层析粗分,收集有活性的洗脱液（70%乙醇洗脱液）。②再经SP阳离子柱纯化,用超滤管对蛋白洗脱液脱盐浓缩。③最后用HPLC高效液相色谱进一步纯化。利用BCA试剂盒测定纯化得到的重组蛋白PlnE和PlnF浓度,分别为2.629 mg/mL 和 2.397 mg/mL。4.PlnE、PlnF 和 PlnEF 的抑菌机制研究。PlnE、PlnF 和 PlnEF的抑菌谱结果显示,它们不仅能抑制革兰氏阳性菌还能抑制革兰氏阴性菌;PlnE、PlnF和PlnEF对藤黄微球菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为5.12 μM、10.24 μM和1.28 μM;对藤黄微球菌抑菌试验结果表明PlnEF的抑菌效果明显比单独的PlnE或PlnF好,PlnE的抑菌效果比PlnF强;荧光探针泄漏实验结果表明,说明PlnEF对藤黄微球菌的作用方式是在细胞膜上形成孔洞,细胞膜内容物泄漏,导致细胞死亡。