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长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）是人肠道中丰度最高的双歧杆菌,应用最为广泛的益生菌之一。具有拮抗致病菌、调节免疫反应、调节糖脂代谢、改善肠道动力等诸多功效,并且被美国食品药品管理局（FDA）与欧洲食品安全局（EFSA）认证为安全可食用菌种。2010年,我国卫生部将其列入《可用于食品的菌种名单》。市场上应用较为广泛的长双歧菌株为日本的BB536、丹麦的NCC2705,中国尚未具有优良益生功能的“明星菌株”,因此,本课题采集中国不同地区人群粪便样本,分离筛选长双歧杆菌菌株,比较基因组学方法解析各菌株遗传背景,体外测定益生功能相关的生理特性,动物模型评估对免疫调节和提高肠道动力的作用,临床试验验证菌株缓解慢性便秘的效果,以期筛选具有缓解结肠炎与功能性便秘长双歧杆菌益生菌株,打造具有自主知识产权的中国“明星菌株”。主要研究成果如下:首先,处理中国不同地区、年龄、民族的14个省（17个地区）人群粪便样本,分离筛得到长双歧杆菌菌株158株,进行全基因组草图测序、组装、功能注释及遗传进化分析。基于同源基因序列构建的遗传系统发育树中,不同宿主分离源长双歧杆菌无明显地区、年龄、性别类聚现象。泛基因组共含有11117个基因,核心基因组含有854个基因,主要涉及细胞的管家基因功能,特别是与碳水化合物（12.83%）和氨基酸（11.57%）代谢及运输功能。基因组共编码32种糖苷水解酶家族,高于双歧杆菌属中其他菌种,主要为降解植物源多糖、动物源多糖以及淀粉的糖苷水解酶。其中数目最多的为GH13家族,平均编码10.5个基因。其次是GH43家族,平均编码4.5个基因,每株菌2～10个不等。菌株中共检测出5种抗性基因ileS、rpoB、tetW、tet（W/N/W）和AAC（6’）,其中ileS和rpoB在所有菌株中保守存在。serpin、bsh基因保守存在于长双歧杆菌中,而pili基因在不同菌株中差异较大。进一步在遗传系统发育树随机挑选20株遗传关系较远菌株进行益生功能相关的生理特性分析发现,不同菌株在模拟胃肠道环境耐受性、细胞粘附特性、抗生素耐受性以及低聚糖利用特性方面具有株间差异,菌株FGDLZ8M1、FJSNT70M6具有良好的益生功能相关性状,FGSZY6M4较差。菌株安全性分析表明,菌株对红霉素、庆大霉素、利奈唑胺、链霉素、四环素、万古霉素和利福平敏感,部分菌株具有卡那霉素、新霉素抗性表型。通过建立DSS诱导小鼠结肠炎模型评估不同长双歧杆菌缓解结肠炎效果。灌胃小鼠FGDLZ8M1菌株能显著抑制DSS导致的小鼠体重下降、结肠缩短、结肠组织细胞隐窝结构破坏等生理特性的改变,效果优于其余三株,促进肠道上皮细胞紧密连接蛋白表达水平,提高肠道屏障功能,而菌株FGSZY16M3、FBJ20M1则没有显著效果。菌株FGDLZ8M1能显著提高结肠中短链脂肪酸含量和产短链脂肪酸肠道菌丰度,改善DSS破坏的菌群结构。菌株生理特性和基因特点与小鼠炎症指标关联性分析表明,长双歧杆菌缓解结肠炎与菌株对模拟胃肠道消化液耐受能力显著相关,耐受能力越强,缓解DSS诱导结肠炎效果越好;有效菌株基因组中含有丰度较高的碳水化合物代谢相关基因。进一步分析效果好菌株FGDLZ8M1与效果差菌株基因组发现,能有效缓解结肠炎菌株FGDLZ8M1有12个菌株特有基因,主要与植物源多糖代谢、细胞抗逆性（抵抗酸碱胁迫）、细胞壁或膜合成等有关。综上分析,具有良好模拟胃肠液耐受能力以及肠道中产短链脂肪酸能力的长双歧杆菌能有效缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。通过临床试验的荟萃分析评估益生菌缓解功能性便秘效果,分析来自10个国家15项临床研究的1189病人发现,益生菌显著提高便秘病人排便频率0.98次/周,降低肠道转运时间13.75 h,提高粪便性状评分1.31。基于菌种数量与类型亚组分析表明,益生菌缓解功能型便秘具有种/株间特异性,多种菌株组合缓解便秘效果优于单一菌种。多元回归分析表明,益生菌提高排便频率效果与益生菌剂量或干预时间无关,益生菌降低肠道转运时间效果随病人年龄增长而降低。通过建立洛哌丁胺诱导小鼠便秘实验评估不同长双歧杆菌缓解功能性便秘效果并通过比较基因组学分析不同效果菌株基因差异。长双歧缓解小鼠洛哌丁胺诱导的便秘有株间差异,菌株FJSNT70M6、FHNBA4M1和FGDLZ8M1缓解显著提高小鼠肠道转运时间、粪便含水量和排便频率,显著提高结肠中短链脂肪酸含量,菌株FGSZY6M4和菌株FBJBA20M1无显著效果。相比于效果差的菌,效果好的菌株共同拥有特异的阿拉伯聚糖酶基因簇。分析HMP和Meta HIT数据库中人肠微生物宏基因组数据发现,便秘病人肠道中该基因簇丰度显著低于健康人。与单独喂食阿拉伯聚糖或长双歧杆菌组相比,同时喂食具有该基因簇的菌株和阿拉伯聚糖组能显著改善小鼠便秘症状,证实该基因簇在长双歧杆菌缓解便秘过程中起重要作用。通过临床试验评估有无该阿拉伯聚糖酶基因簇的长双歧杆菌对功能性便秘病人便秘指标缓解状况。具有该基因簇的菌株L6、FGDLZ8M1能显著提高便秘病人排便频率、改善粪便性状、改善生活质量等,而另一株不含该基因簇的菌株FGSZY6M4无显著效果。与安慰剂相比,长双歧杆菌L6、FGDLZ8M1增加周排便次数分别为1.05±0.95、1.15±1.27次,而菌株FGSZY6M4仅增加0.43±0.93次。并且长双歧杆菌L6、FGDLZ8M1显著改善便秘患者粪便性状,而菌株FGSZY6M4则不能。