抑制Dicer的表达对哺乳动物细胞中CpG岛甲基化的影响

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cscec83
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Dicer是siRNA生物合成过程中的关键酶。研究表明Dicer能够在很多物种中调节异染色质的形成,影响DNA甲基化和组蛋白修饰,但是,哺乳动物细胞中Dicer是否具有类似的功能,目前尚不十分清楚。  目的:  本文旨在研究Dicer对哺乳动物细胞中基因启动子的CpG岛DNA甲基化的调节及相应蛋白编码基因表达的影响,并初步探讨在Dicer低表达的细胞中,基因启动子的CpG岛DNA甲基化的水平与基因表达水平的相关性。  方法:  1.用人结肠癌细胞HCT116构建Dicer低表达稳定细胞系,通过RT-PCR及westernblot鉴定阳性克隆。  2.在HCT116细胞中瞬时转染Dicer siRNA抑制Dicer的表达,用RT-PCR及western blot检测转染效果。  3.在稳转及瞬转细胞中用实时定量RT-PCR检测基因的表达水平。用Bisulfitesequencing技术检测细胞中基因启动子CpG岛的甲基化水平。  结果:  1.成功构建了Dicer低表达的HCT116稳定细胞系。  2.在抑制Dicer表达的稳定细胞系中,CPEB2、ICAM-1、LHFP、LIPG、PELI2、SERTAD4、RTN1、SFRP4的mRNA水平增加,LHFP和ICAM-1的CpG岛的DNA甲基化水平降低。  3.在瞬时转染Dicer siRNA的HCT116细胞中,抑制Dicer的表达能够诱导CPEB2、PELI2、RTN1基因的表达,降低LHFP和ICAM-1基因启动子CpG岛的DNA甲基化水平。  结论:  1.抑制Dicer的表达导致一些基因的表达水平上升。  2.抑制Dicer的表达可以在基因组的某些局部区域调节DNA甲基化。  3.在抑制Dicer表达的条件下,基因表达改变并不一定伴有CpG岛DNA甲基化水平改变。
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