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眼斑芫菁(Mylabris cichorii)俗名为黄黑小斑蝥，属于芫菁科(Meloidae)昆虫。它是传统的中药材。当它受到外界刺激时在其腿节处会分泌一种黄色的粘稠状的液体，这种液体的主要成分为斑蝥素(cantharidin)。斑蝥素是一种萜类物质，它是芫菁科昆虫的一种天然的防御物质。斑蝥素是一种有效的抗癌药物，在芫菁科昆虫的各个发育阶段中都存在。斑蝥素的合成呈现典型的性二型现象，雄虫合成斑蝥素而雌虫基本不合成。雄虫合成斑蝥素后，将斑蝥素储存在生殖器中，与雌虫交配后，将斑蝥素转移至雌虫体内，雌虫再将斑蝥素传替给下一代，保护下一代不受外来侵害。目前对于斑蝥素的致病机理、斑蝥素的提取及测定方法等方面的研究比较成熟。关于斑蝥素的生物合成途径的研究，一直是科学领域中的一个热点。斑蝥素生物合成的研究已经经历了数十年，也取得了一些成果，但是至今仍没有发现斑蝥合成的代谢通路。20世纪科学家们采用同位素标记实验发现了斑蝥素的合成前体为法尼醇，且其分子中O原子来自于O2和H2O，并由此推测斑蝥素的生物合成途径可能与甲羟戊酸途径（MAV）有关。目前有关斑蝥素合成途径的分子生物学方面的研究较少，斑蝥素合成相关基因的发现，利于后期斑蝥素生物合成的研究。本实验室汪会荣、王宇等对眼斑芫菁的研究发现雄虫斑蝥素的合成时期为第5天至第30天，其中第20天到第25天为合成的高峰期，并构建了雌、雄差减文库，在此基础上，我们通过RACE技术克隆获得了眼斑芫菁1,4-二羟基萘甲酸聚异戊烯基转移酶MenA基因，将其命名为McMenA，并对其进行功能研究。主要研究结果如下：1. McMenA基因全长的克隆及生物信息学分析根据已知的McMenA基因的EST序列，设计特异性引物，采用RACE技术获得了该基因的全长序列，将其命名为McMenA，Genbank登录号为KJ156619。其基因结构不含内含子，全长序列为1264bp，其中编码区1026bp，5’UTR为114bp，3’UTR为124bp，共编码341个氨基酸，使用ExPASy在线软件分析，预测其蛋白分子量为37.9KD，理论等电点为8.94，蛋白结构具有1,4-二羟基萘甲酸聚异戊烯基转移酶典型的富含天冬氨酸的保守结构域N/DDxxD，TMHMM预测发现，该蛋白为多次跨膜蛋白，具有七个跨膜结构区，亚细胞定位预测发现其定位于线粒体膜上，不具有信号肽推测其不是分泌型的蛋白。同源性分析比对显示，眼斑芫菁的1,4-二羟基萘甲酸聚异戊烯基转移酶基因与其他昆虫类的1,4-二羟基萘甲酸聚异戊烯基转移酶基因具有较高的同源性，其中与赤拟谷盗Tribolium castaneum的同源性最高，同源性达到86%。2.实时荧光定量RT-qPCR检测雌、雄成虫羽化后不同时期McMenA基因的表达运用RT-qPCR技术分析雌、雄成虫羽化后第5天、10天、15天、22天、25天、30天六个时期的McMenA基因的表达情况。结果显示McMenA基因在雄虫的各个时期均有表达，在斑蝥素合成的旺盛时期20天-25天，McMenA基因表达量最高，在斑蝥素合成持续增长时期5-25天，雄虫McMenA基因在这时期内表达量也不断的升高，第25天到第30天，即斑蝥素合成量减少的时期，雄虫McMenA基因也相对应的下调表达。雌虫中，McMenA基因在各个时期也均有表达，在前期第5天-15天McMenA基因的表达量较稳定，基本没什么变化，但在雄虫合成斑蝥素的旺盛时期22-25天，雌虫的McMenA基因表达量表达量极低。这与雌虫当中斑蝥素的合成时期及合成量是相一致。McMenA基因在雌、雄成虫的表达量与斑蝥素呈正相关。3. RT-qPCR检测第22天雄虫各组织中McMenA基因的表达量对定量结果分析，发现McMenA基因在雄虫的精巢、附腺、前肠、中肠、后肠中均有表达，其中在精巢中表达量最高，与附腺相比呈极显著差异，在中肠及后肠中的表达量基本一致。4.利用RNAi技术对McMenA基因的功能进行研究通过体外合成McMenA基因的干扰片段dsRNA，注射入羽化后21天的雄虫体内，抑制McMenA基因表达，干扰24h及48h后，运用RT-qPCR检测McMenA基因的表达量发现，24h后McMenA基因的表达量显著低于对照组，干扰效率达到了88%，成功的实现了McMenA基因的干扰。5.测定干扰24h后，雄虫体内斑蝥素及ATP含量我们测定了McMenA-dsRNA注射24小时实验组和对照组体内斑蝥素和ATP的含量，结果显示，McMenA基因被干扰后雄虫体内的斑蝥素及ATP含量均明显低于正常雄虫。结论：McMenA影响眼斑芫菁ATP的合成；McMenA与眼斑芫菁斑蝥素的合成相关，但这种相关是直接影响斑蝥素合成还是由于影响ATP合成而间接影响斑蝥素合成还需进一步研究。