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第一部分PD-1和PD-L1在早孕期蜕膜巨噬细胞和绒毛中表达的研究【目的】通过检测早孕期正常妊娠(Normal pregnancy,NP)妇女和反复自然流产(Recurrent miscarriages,RM)患者蜕膜组织中M1和M2型蜕膜巨噬细胞(Decidual macrophage,DM)百分比,以及程序性死亡受体(Programmed cell death,PD)-1及其配体(PD-1 ligand,PD-L)-1在DM的表达水平,PD-L1在NP妇女和RM患者绒毛组织的表达水平,探讨早孕期母-胎界面DM表型与PD-1/PD-L1信号通路之间的关系。【方法】以NP妇女(n=20)为对照组,RM患者(n=16)为病例组,收集流产后蜕膜组织,采用流式细胞技术检测早孕期NP妇女和RM患者蜕膜组织中M1(CD14+CD80+/CD14+CD86+/CD14+CD80+CD86+)和M2(CD14+CD163+/CD14+CD206+/CD14+CD163+CD206+)型DM百分比,以及PD-1和PD-L1在DM的表达水平;同时采集NP妇女(n=19)和RM患者(n=15)绒毛组织,采用定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)和Western Blot技术分别检测绒毛组织中PD-L1 m RNA和蛋白表达水平。【结果】早孕期NP妇女和RM患者蜕膜中均存在M1和M2型DM:NP妇女中DM以M2型为主,RM患者中DM以M1型为主;与NP妇女相比,RM患者中M1型(CD14+CD80+/CD14+CD86+/CD14+CD80+CD86+)DM百分比增加(P<0.01),M2型(CD14+CD163+/CD14+CD206+)DM百分比则明显减少(P<0.05);与NP妇女相比,RM患者中M1(CD14+CD80+/CD14+CD86+/CD14+CD80+CD86+)和M2(CD14+CD163+/CD14+CD206+)型DM中PD-1表达水平明显减少(P<0.05);与NP妇女相比,RM患者中M2(CD14+CD163+)型DM中PD-L1表达水平明显减少(P<0.05);与NP妇女相比,RM患者绒毛组织表达PD-L1 m RNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.001)。【结论】与其他分子标记相比,CD14+CD86+和CD14+CD206+是分别界定早孕期M1和M2型DM的最佳分子标记;RM患者中M1型DM百分比增加,M2型DM百分比降低,也许与其表面PD-1表达降低,以及绒毛组织中PD-L1表达降低有关。第二部分PD-1/PD-L1信号通路调控早孕期巨噬细胞分化和功能的研究【目的】通过体外激活或阻断巨噬细胞分化过程中PD-1/PD-L1信号通路,检测早孕期单核细胞在体外分化为巨噬细胞的表型和功能,探讨PD-1/PD-L1信号通路对早孕期巨噬细胞分化和功能的调控效应。【方法】收集早孕期NP妇女(n=50)外周血,采用免疫磁珠试剂盒分选CD14+单核细胞,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Recombinate human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rh GM-CSF)(50 ng/m L)体外活化,单独培养或与PD-L1 Fc(10μg/m L)、anti-PD-L1 m Ab(10μg/m L)和anti-PD-1 m Ab(10μg/m L)共培养7天,采用流式细胞技术检测M1(CD14+CD86+)和M2(CD14+CD206+)型巨噬细胞百分比,以及巨噬细胞吞噬功能;同时,采用q RT-PCR方法检测巨噬细胞分化相关转录因子(Interferon regulatory factor,IRF)-4,5和细胞因子白介素(Interleukin,IL)-1β和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-αm RNA表达水平。【结果】与对照组相比,M2型巨噬细胞百分比在PD-L1 Fc处理组明显上调(P<0.05),M1型巨噬细胞百分比则明显降低(P<0.01);anti-PD-1 m Ab明显上调M1型巨噬细胞百分比(P<0.001),M2型巨噬细胞百分比则明显降低(P<0.01);anti-PD-L1m Ab则对M1和M2型巨噬细胞百分比影响不大(P>0.05)。与对照组相比,巨噬细胞吞噬功能在PD-L1 Fc处理组明显增强(P<0.01),anti-PD-1 m Ab处理组中巨噬细胞吞噬功能明显减弱(P<0.001),而anti-PD-L1 m Ab对巨噬细胞吞噬功能影响不大(P>0.05)。同时,在PD-L1 Fc处理组,M2型巨噬细胞转录因子IRF4 m RNA表达明显增加(P<0.05),M1型巨噬细胞转录因子IRF5 m RNA表达则明显降低(P<0.01);anti-PD-1 m Ab阻断PD-1信号传导,则明显抑制IRF4 m RNA表达(P<0.05),促进IL-1β和TNF-αm RNA表达水平(P<0.05);anti-PD-L1 m Ab则对IRF4、IRF5、IL-1β和TNF-αm RNA表达水平无明显调控效应(P>0.05)。【结论】PD-1/PD-L1信号通路活化,促进早孕期单核细胞向M2型巨噬细胞分化,增强巨噬细胞吞噬功能,抑制促炎型细胞因子IL-1β和TNF-α转录;阻断PD-1/PD-L1信号通路,则促进M1型巨噬细胞分化,抑制巨噬细胞吞噬功能,并增强促炎型细胞因子IL-1β和TNF-α转录。因此,PD-1/PD-L1信号通路对早孕期巨噬细胞分化和功能存在调控效应。第三部分PD-1/PD-L1信号通路调控早孕期巨噬细胞分化和功能的分子机制【目的】通过体外激活或阻断PD-1/PD-L1信号通路,体外诱导早孕期单核细胞分化为巨噬细胞,检测诱导分化的巨噬细胞中物质(葡萄糖、脂肪酸和谷氨酰胺)代谢相关基因和信号传导分子的m RNA表达水平,阐明PD-1/PD-L1信号通路调控早孕期巨噬细胞分化和功能的分子机制。【方法】收集早孕期NP妇女(n=8)外周血,采用免疫磁珠试剂盒分选CD14+单核细胞,经rh GM-CSF(50 ng/m L)体外活化,单独培养或与anti-PD-1 m Ab(10μg/m L)共培养7天,采用q RT-PCR技术检测分化后巨噬细胞中PD-1/PD-L1信号通路相关分子磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of Rapamycin,m-TOR)和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(Mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MEK)、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)m RNA的表达水平,以及葡萄糖、脂肪酸和谷氨酰胺相关转运体和分解代谢关键酶m RNA的表达水平。【结果】与对照组相比,anti-PD-1 m Ab处理组巨噬细胞中葡萄糖转运体(Glucose transporter,Glut)-1 m RNA表达水平,以及葡萄糖酵解关键酶己糖激酶(Hexokinase,HK)-2和丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)-1 m RNA表达水平明显升高(P<0.01),乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)-1 m RNA表达水平略升高但无明显差异(P>0.05);与对照组相比,anti-PD-1 m Ab处理组巨噬细胞中氨基酸代谢中谷氨酰胺转运体(Sodium-coupled neutral amino acid transporter,SNAT)-1和2 m RNA表达水平明显升高(P<0.01);与对照组相比,anti-PD-1 m Ab处理组巨噬细胞中脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FASN)m RNA表达水平明显升高(P<0.05),而脂肪酸转运体肉毒碱棕榈酰转移酶(Carnitine palmitoyltransferase,CPT)1A m RNA表达水平无明显变化(P>0.05);同时,采用anti-PD-1 m Ab阻断PD-1信号传导促进巨噬细胞中信号传导分子PI3K、AKT、m-TOR和MEK、ERK m RNA的表达(P<0.01)。【结论】阻断PD-1/PD-L1信号通路,诱导早孕期巨噬细胞向M1型分化,也许是通过促进细胞无氧糖酵解和抑制细胞脂肪酸氧化实现的,并且受PI3K/AKT/m-TOR和MEK/ERK信号分子调控。第四部分滋养细胞来源的可溶性PD-L1促进巨噬细胞向M2型分化【目的】采集早孕期NP妇女绒毛组织,分离人原代滋养细胞,并进一步分析人滋养细胞系和人原代滋养细胞产生可溶性PD-L1(Soluble PD-L1,s PD-L1)的水平;建立滋养细胞条件性培养基(Trophoblast conditioned medium,TCM)诱导单核细胞分化为巨噬细胞的实验模型,通过阻断PD-1/PD-L1信号通路,检测M1和M2型巨噬细胞百分比和细胞因子分泌水平。【方法】收集早孕期NP妇女绒毛组织,采用酶消化法分离滋养细胞并体外培养,获取人滋养细胞系(Swan 71细胞和3A细胞)和人原代滋养细胞低血清培养条件下培养上清和细胞,采用Western Blot和Simple Plex方法分析膜PD-L1(Membrane PD-L1,m PD-L1)和s PD-L1在滋养细胞的基础表达水平;同时采集具有正常生育力的妇女外周血,免疫磁珠法分选CD14+单核细胞,建立TCM诱导单核细胞分化为巨噬细胞的实验模型,采用anti-PD-1 m Ab(10μg/m L)阻断PD-1/PD-L1信号通路,检测培养7天后M1和M2型巨噬细胞百分比和细胞因子分泌水平。【结果】m PD-L1和s PD-L1在Swan 71细胞均表达;与m PD-L1相比,s PD-L1分泌水平随时间进展逐渐增加(P<0.01),在3A和人原代滋养细胞中均存在与Swan 71细胞相似的s PD-L1的分泌曲线(P<0.01);TCM诱导巨噬细胞分化模型发现,TCM诱导M2型巨噬细胞分化,而anti-PD-1 m Ab处理组中M2型巨噬细胞明显减少;此外,anti-PD-1 m Ab处理组中巨噬细胞经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)活化后,分泌更高水平的促炎细胞因子,如IL-6和TNF-α。【结论】滋养细胞组成性分泌s PD-L1,体外阻断PD-1受体,减弱TCM对巨噬细胞分化为M2型的促进作用;这些数据表明滋养细胞来源的s PD-L1参与M2型巨噬细胞的分化。第五部分阻断PD-1信号传导对正常妊娠小鼠胚胎吸收和子宫巨噬细胞表型的调控效应【目的】建立正常妊娠和流产倾向小鼠模型,采用PD-1抗体阻断正常妊娠小鼠中PD-1/PD-L1信号传导,检测各妊娠小鼠胚胎吸收率,子宫和脾脏M1和M2型巨噬细胞百分比,以及PD-1在子宫和脾脏巨噬细胞的表达,在体探讨PD-1/PD-L1信号通路对妊娠结局和巨噬细胞分化的调控作用。【方法】采用CBA/J♀(n=8)和BALB/c♂建立正常妊娠小鼠模型,随机分为两组,分别于妊娠4.5天、6.5天和8.5天给予anti-PD-1 m Ab或等量无菌PBS,均为腹腔注射;采用CBA/J♀(n=4)和DBA/2♂建立流产倾向小鼠模型。于妊娠第10.5天,处死孕鼠,计数胚胎吸收率,分离孕鼠子宫和脾脏,采用流式细胞技术检测子宫和脾脏中M1和M2型巨噬细胞百分比,以及PD-1在子宫和脾脏巨噬细胞的表达水平。【结果】与正常妊娠CBA/J×BALB/c小鼠相比,anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠中胚胎吸收率明显升高(P<0.05),而anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠组胚胎吸收率无明显差异(P>0.05)。与健康妊娠CBA/J×BALB/c小鼠相比,子宫M2型巨噬细胞百分比和M1/M2比值在anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠明显降低(P<0.05),而anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠组间则无明显差异(P>0.05)。子宫M1型巨噬细胞百分比在三组之间没有明显差异(P>0.05);脾脏M1和M2型巨噬细胞百分比在三组之间也没有明显差异(P>0.05),但与正常妊娠小鼠相比,子宫和脾脏M1/M2比值在anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠明显升高(P<0.05)。与正常妊娠CBA/J×BALB/c小鼠相比,子宫巨噬细胞PD-1表达水平在anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠中明显降低(P<0.05);而其在anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠间则无明显差异(P>0.05)。与正常妊娠CBA/J×BALB/c小鼠相比,PD-1在脾脏巨噬细胞表达水平在CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠中明显降低(P<0.05),而与anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠间无明显差异(P>0.05)。此外,与正常妊娠CBA/J×BALB/c小鼠相比,子宫PD-1+M2型巨噬细胞百分比在的anti-PD-1 m Ab处理CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠明显降低(P<0.05),而anti-PD-1 m Ab处理的CBA/J×BALB/c妊娠小鼠和CBA/J×DBA/2流产倾向小鼠之间无明显差异(P>0.05)。脾脏PD-1+M2型巨噬细胞在三组之间无明显差异(P>0.05)。【结论】PD-1/PD-L1信号传导减弱或缺失与胚胎吸收率升高和子宫M1/M2比值升高相关,即阻断PD-1信号传导导致胚胎吸收率升高,同时伴有子宫M2型巨噬细胞减少。母-胎界面PD-1表达缺失,也许是导致流产倾向小鼠胚胎吸收率升高和子宫M1/M2比值升高的关键因素。