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水环境中重金属污染导致水产品中重金属超标问题时有发生,严重影响人体健康。微生物对重金属的生物积累作用是目前重金属脱除研究的热点之一,活性微生物具有在复杂食品物料体系如液态水产制品中脱除重金属的能力。良好的重金属抗性和积累特性是应用该方法的必要前提,是活性微生物脱除重金属的重要保障。本文系统研究了多抗性库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii A16)的重金属(镉、铜和锌)抗性、积累特性和脱除能力,研究了高盐或低pH对P. kudriavzevii A16重金属抗性、积累特性和脱除能力的影响,并对高盐或低pH条件下P.kudriavzevii A16镉抗性提高机理进行了深入的探讨。1.以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC1211)为对照菌株,系统研究了P. kudriavzevii A16的重金属(镉、铜和锌)抗性、积累特性和脱除能力。结果表明,P. kudriavzevii Al6具有很高的镉、铜和锌抗性与积累特性,并且对镉和锌具有很强的脱除能力,对于低于0.04 mmol/L的镉和0.1 mmol/L锌的脱除率均超过95%。这两株酵母对某一种重金属的积累作用明显受到其它重金属离子的影响,铜和锌离子显著降低两株酵母的单位菌体镉积累量,镉和锌离子明显提高两株酵母的单位菌体铜积累量,P. kudriavzevii A16的单位菌体锌积累量在镉和铜离子作用下显著下降,而S. cerevisiae CICC1211的却有所提高。在相同积累时间、初始重金属浓度和初始菌体浓度或其它重金属离子存在的条件下,P. kudriavzeviiA16的重金属脱除能力均显著高于S. cerevisiae CICC1211。2.为了明确高盐或低pH条件下活性P. kudriavzevii A16在重金属(镉、铜和锌)脱除上的应用潜力,以S. cerevisiae CICC1211为对照菌株,分别系统研究了高盐或低pH对P. kudriavzevii A16重金属抗性、积累特性和脱除能力的影响。结果表明,高盐或低pH显著提高两株酵母的镉抗性,这可能与单位菌体镉积累量特别是细胞内镉积累量的显著下降有很大关系。与对镉抗性的影响完全不同,高盐或低pH条件下两株酵母的铜抗性显著下降,单位菌体铜积累量特别是细胞内铜积累量的显著上升对其铜抗性的下降可能有很大影响。两株酵母的锌抗性无显著变化,然而两株酵母的单位菌体锌积累量均有所提高。与对S. cerevisiae CICC1211的影响不同,高盐或低pH并没有明显降低活性P. kudriavzevii A16 的镉、铜和锌脱除能力,反而在某些条件下提高了其脱除能力。在高盐或低pH下,P. kudriavzevii A16对镉、铜和锌的脱除能力均显著高于S. cerevisiae CICC 1211。3.采用转录组学技术研究高盐或低pH下P. kudriavzevii A16的镉抗性提高机理。运用RNA-Seq结合de novo组装技术在转录组水平上研究高盐-镉胁迫与镉胁迫、低pH-镉胁迫与镉胁迫等条件下P. kudriavzevii A16的基因表达差异,选择FPKM值为4倍差异变化且FDR<0.001的转录本作为差异表达转录本进行功能注释和分析。高盐-镉胁迫与镉胁迫之间共筛选出差异表达转录本62个：涉及抗氧化活性、应激反应、甘油运输、电子传递等功能的23个转录本在高盐-镉胁迫中表达量上调,而涉及跨膜运输、核糖体生物合成、转录相关功能、细胞壁合成等功能的39个转录本在高盐-镉胁迫中表达量下调。低pH-镉胁迫与镉胁迫之间共筛选出的61个差异表达转录本：涉及应激反应、甘油运输、电子传递、抗氧化活性等功能的32个转录本在低pH-镉胁迫中表达量上调,而涉及跨膜运输、核糖体生物合成、转录相关功能、细胞壁合成等功能的29个转录本在低pH-镉胁迫中表达量下调。4.运用双向凝胶电泳(2-DE)研究高盐或低pH对镉胁迫下P. kudriavzeviiA16蛋白质组的影响。对比各组每个蛋白点的丰度,选择2倍差异变化的蛋白点进行质谱鉴定和功能分析。高盐-镉胁迫与镉胁迫之间共鉴定出差异表达蛋白点39个：涉及物质代谢和能量生成、核糖体合成与转录、抗氧化活性等功能的28个蛋白点在高盐-镉胁迫中表达量上调,而涉及物质代谢、跨膜运输等功能的11个蛋白点在高盐-镉胁迫中表达量下调。低pH-镉胁迫与镉胁迫共鉴定出差异表达蛋白点21个：涉及物质代谢、抗氧化活性等功能的11个蛋白点在低pH-镉胁迫中表达量上调,而涉及物质代谢、跨膜运输等功能的10个蛋白点在低pH-镉胁迫中表达量下调。5.运用SYBR Green qRT-PCR技术对与P. kudriavzevii A16镉抗性提高相关的关键基因进行定量分析。结果发现,高盐或低pH均能显著提高P. kudriavzeviiA16镉胁迫下SODC, SODM, PRX1, PRX2D, CATA等抗氧化物酶基因的表达。抗氧化物酶活力变化与基因表达的变化一致,高盐或低pH下P. kudriavzevii A16的T-SOD、POD和CAT活力均明显高于单独镉胁迫下的活力。抗氧化物酶基因的大量表达在降低镉胁迫下P. kudriavzevii A16细胞内ROS含量、细胞死亡率细胞内脂质过氧化水平、蛋白质氧化损伤水平等方面发挥了很大作用,是P.kudriavzevii A16镉抗性提高的重要原因。此外,高盐或低pH均能显著提高镉胁迫下P. kudriavzevii A16中YCF1、GST, HSP12、RAD57等基因的表达,而这些基因的大量表达对于降低镉毒性、降低氧化胁迫、维持细胞稳定发挥了重要作用。重金属污染是水产品中最为严重的安全问题之一,目前还没有很成熟的方法用于解决水产品中重金属超标问题。本研究的开展,为应用活性微生物脱除液态水产制品中的重金属提供重要参考,为提高微生物重金属抗性和积累性能提供新的思路,也为P. kudriavzevii基础生物学研究和工业应用提供重要的生物学信息。