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前言我国是鼻咽癌发病率较高的国家之一,放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段。由于鼻咽癌病人之间存在着内在的固有的放射敏感性差异,可显著地影响鼻咽癌的放射治愈率。因而准确地预测鼻咽癌的放射敏感性,显得极为重要,但迄今尚未找到预测鼻咽癌放射敏感性的有效指标。实验Ⅰ鼻咽癌放射敏感性与癌基因表达程度的相关关系近年来有文献报道,经癌基因转染的细胞,其放射敏感性与癌基因表达程度有关。但目前尚未见到异常P53蛋白及bcl-2基因表达程度与鼻咽癌放射敏感性相关关系的研究报道。本实验采用免疫组织化学染色技术测定鼻咽癌组织中异常P53蛋白及bcl-2基因表达程度,并分析其与鼻咽癌颈淋巴结转移灶放射敏感性之间的相互关系。材料与方法1.病例2000年1月-2002年1月在中国医科大学附属第一医院初次接受放射治疗的鼻咽癌颈淋巴结转移病人61例,所有病例均经鼻咽部病理组织学证实为低分化鳞癌。2.放射治疗采用直线加速器6MV-X线进行外照射。鼻咽部放射治疗DT70-74Gy,35-37分次,7-8周;颈淋巴结转移灶放射治疗DT66-70Gy,33-35分次,6-7周。3.病灶大小的测量由专人隔日一次用游标卡尺测量颈部最大淋巴结转移灶的最大径(a)及其垂直径(b),按肿瘤体积=ab2/2计算颈淋巴结转移灶体积。4.免疫组织化学染色所有病例的病理切片均行常规HE染色,及异常P53蛋白、bcl-2基因免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法采用SP法。5.阅片由专人采用双盲法阅片,计算阳性细胞数与全部肿瘤细胞数的比值;将比值为0、1-25%、26-50%、51%-75%,＞75%的病例分别定义为-、+、++、+++、++++。6.统计学处理所有数据均采用SPSS10.0软件行统计学处理,用t检验比较各组均数,相关性分析采用Spearman等级相关分析。结果癌基因表达程度与颈淋巴结转移灶消退情况的相关关系;以颈淋巴结转移灶在放射治疗过程中体积缩小25%、50%、75%及完全消退所需的放射剂量代表其放射敏感性,即所需的放射剂量越小放射敏感性越高。在Spearman等级相关分析中,异常P53蛋白及bcl-2基因表达程度,与颈淋巴结转移灶消退过程中所需放射剂量呈正相关(P＜0.05),即与放射敏感性呈负相关关系。另外,异常P53蛋白含量与bcl-2基因表达程度无相关关系(P＞0.05)。讨论本实验分析结果显示,异常P53蛋白及bcl-2基因表达程度与鼻咽癌颈淋巴结转移灶的放射敏感性呈负相关关系(P＜0.05),异常P53蛋白表达程度与bcl-2基因表达程度之间无相关关系(P＞0.05)。异常P53蛋白可能是通过以下途径影响肿瘤的放射敏感性;(1)异常P53蛋白一方面干扰DNA受损伤细胞的C1期抑制,使其继续进入S期。(2)放射治疗后当DNA大量损伤时,异常P53蛋白减少受照射后的细胞凋亡。bcl-2基因可能是通过减少放射所介导的细胞调亡的途径,来影响肿瘤细胞的放射敏感性。实验Ⅱ鼻咽癌放射敏感性与细胞周期蛋白含量的相关关系有研究表明,某些细胞周期蛋白可能与一些肿瘤的预后及其内在的放射敏感性有关。目前临床上尚未见到有关细胞周期蛋白与鼻咽癌放射敏感性相关关系的研究报道。本实验采用免疫组织化学染色技术测定鼻咽癌组织中细胞周期蛋白PCNA、Ki-67及Cyclin B1含量,并分析其与鼻咽癌颈淋巴结转移灶放射敏感性之间的相互关系。材料与方法1.病例同实验Ⅰ。2.放射治疗同实验Ⅰ。3.病灶大小的测量同实验Ⅰ。4.免疫组织化学染色所有病例的病理切片均行常规HE染色,及PCNA、Ki-67及Cyclin B1免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法采用SP法。5.阅片同实验Ⅰ。6.统计学处理同实验Ⅰ。结果细胞周期蛋白含量与颈淋巴结转移灶消退情况的相关关系;以颈淋巴结转移灶在放射治疗过程中体积缩小25%、50%、75%及完全消退所需的放射剂量代表其放射敏感性,即所需的放射剂量越小,放射敏感性越高。在Spearman等级相关分析中,细胞周期蛋白PCNA及Ki-67的含量与颈淋巴结转移灶消退过程中所需放射剂量呈负相关关系(P＜0.05),即与放射敏感性呈正相关关系,而细胞周期蛋白Cyclin B1的含量与颈淋巴结转移灶消退过程中所需放射剂量无相关性(P＞0.05)。另外,细胞周期蛋白PCNA与Ki-67含量呈正相关关系(P＜0.05);两者均与细胞周期蛋白Cyclin B1含量无相关关系(P＞0.05)。讨论本研究发现,鼻咽癌组织内PCNA含量不同,其颈淋巴结转移灶的放射敏感性也明显不同,二者呈正相关关系。这可能是因为PCNA作为细胞增殖的主要标记物与细胞增殖率明确相关,而细胞增殖率又与肿瘤放射敏感性呈正相关关系。本研究中细胞周期蛋白Ki-67含量与鼻咽癌颈淋巴结转移灶的放射敏感性呈正相关关系,符合增殖率高的肿瘤放射敏感性高的规律。结论本研究发现鼻咽癌组织中异常P53蛋白和bcl-2基因表达程度与鼻咽癌颈淋巴结转移灶的放射敏感性成负相关关系,PCNA和Ki-67蛋白含量与鼻咽癌颈淋巴结转移灶的放射敏感性成正相关关系,而细胞周期蛋白Cyclin B1含量与其无关。由于颈淋巴结转移灶与原发灶病理类型同源,所以异常P53蛋白、bcl-2基因表达程度及PCNA、Ki-67蛋白含量可以预测鼻咽癌的放射敏感性,准确性高于通过肿瘤分化程度来判定其放射敏感性的方法。第二部分重组人干扰素α-2a对人鼻咽癌细胞系CNE-1的放射增敏效应前言近年来发现,干扰素α不单具有肿瘤细胞毒性作用,还具有诱导肿瘤细胞调亡及调控肿瘤细胞增殖周期的作用。由于肿瘤细胞的放射敏感性与细胞在增殖周期各时相的分布密切相关,干扰素α可能会改变肿瘤细胞的放射敏感性。目前国内外尚未见到干扰素影响鼻咽癌放射敏感性的研究报道。本实验采用细胞集落形成方法来研究重组人干扰素α-2a对人鼻咽癌细胞系CEN-1放射敏感性的影响。实验材料1.培养细胞人鼻咽癌细胞系CNE-Ⅰ。2.药物重组人干扰素α-2a(IFNα-2a)。实验前将药物用PRMI1540培养液配制成所需的浓度(0.5×10~3IU/ml,1.0×10~3IU/ml,1.5×10~3IU/ml)。3.主要设备FACS can流式细胞仪。二氧化碳培养箱,倒置显微镜,直线加速器。实验方法1.IFNα-2a对CNE-Ⅰ细胞放射敏感性的影响;将培养瓶内对数生长期的CEN-Ⅰ细胞胰酶消化,计数活细胞数,逐级稀释后将细胞接种于6cm平皿中。将其分成四组进行实验;(1)对照组不做任何处理;(2)单纯用药组分别加入含IFNα-2a 0.5×10~3IU/ml、1.0×10~3IU/ml及1.5×10~3IU/ml的培养基5ml,继续培养24小时后,立即除去药物,继续培养14天;(3)单纯放射组使用6MVX线分别照射1、3、5、7、9Gy,照射后继续培养14天;(4)药物加放射组不同浓度IFNα-2a作用24小时后进行照射,条件同(2)(3)。培养14天后计数细胞集落数。计算细胞存活率,绘制细胞存活曲线。根据细胞生存曲线计算IFNα-2a在10%存活率水平时的放射增敏比。2.IFNα-2a对CNE-Ⅰ细胞增殖周期的影响;将培养瓶内对数生长期的CNE-Ⅰ细胞胰酶消化。将其分成二组进行实验;(1)对照组不做任何处理;(2)用药组加入含IFNα-2a 1.0×10~3IU/ml的培养液5ml,继续培养24小时后立即除去药物,继续培养。分别取对照组和除去药物后培养0、24、48h用药组的培养细胞,消化并制成单细胞悬液。DNA含量的检测;常规方法用流式细胞仪检测CNE-Ⅰ细胞内DNA含量,推算出细胞增殖周期中各时相细胞的分布。结果1.IFNα-2a对CNE-Ⅰ细胞放射敏感性的影响由细胞相对存活曲线可以测出在10%细胞存活水平时,0.5×10~3IU/ml、1.0×10~IU/ml、1.5×10~3IU/ml IFNα-2a作用24小时后的SER分别为1.16、1.61、1.85。2.IFNα-2a对CNE-Ⅰ细胞增殖周期的影响IFNα-2a作用于CNE-Ⅰ细胞后24h,CNE-Ⅰ细胞周期时间(46.6h)较对照组(38.8h)延长(P＜0.05),其中G1期时相(23.3h)延长和S期时相(4.2h)缩短与对照组(17.6h和6.9h)相比均有统计学意义(P＜0.05)。IFNα-2a作用于CNE-Ⅰ细胞后0、48h,CNE-Ⅰ细胞周期各时相变化与对照组相比均不明显(P＞0.05)。讨论本实验发现,1.0×10~3IU/ml IFNα-2a作用后24h,CNE-Ⅰ细胞增殖周期S期时间较对照组缩短,有统计学意义。实验还发现随着IFNα-2a浓度的增大,人鼻咽癌细胞CNE-Ⅰ放射后的生存曲线形状发生变化,直线部分的斜率增大,说明IFNα-2a具有一定的放射增敏效应,且IFNα-2a放射增敏效应呈浓度依赖性。这可能与IFNα作用于CNE-Ⅰ细胞后,诱导细胞增殖周期S期缩短,使处于放射抵抗的S期细胞减少,导致CNE-Ⅰ细胞放射敏感性增高有关。干扰素能导致鼻咽癌细胞增殖周期S时相缩短,从而提高鼻咽癌放射敏感性的研究结果,可能为临床放射治疗过程中使用干扰素进行综合治疗提供了理论依据。结论人重组干扰素α-2a对人鼻咽癌细胞CNE-1具有放射增敏效应;人重组干扰素α-2a可导致人鼻咽癌细胞CNE-Ⅰ细胞周期G1时相延长及S时相缩短。