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间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类非造血干细胞,不仅来源广泛而且具有一定的可塑性以及可以诱导分化为不同类型的细胞,如成骨细胞和基质细胞等。MSCs通过分化参与组织损伤修复的能力使其成为临床上最具应用前景的干细胞类型之一。近年来随着研究的深入,人们发现,MSCs不仅可以通过定向分化替代受损组织,而且还可以通过旁分泌作用参与损伤修复。肌腱损伤是临床常见的疾病之一。基于干细胞的肌腱损伤修复研究表明,多种因素可以诱导干细胞向肌腱细胞定向分化,包括细胞因子、力学拉伸、共培养环境等。但是,虽然有报道表明MSCs旁分泌可促进多种组织的损伤修复,但MSCs旁分泌作用是否参与肌腱损伤修复目前还未有报道。本文的主要研究目的是探究大鼠骨髓MSCs条件培养基(conditioned medium from rat bone marrow derived mesenchymal stem cells,r MSCs-CM)对大鼠肌腱细胞增殖的影响以及信号分子ERK1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)在此过程中的作用及其对肌腱细胞细胞周期的影响。具体的工作内容和结果如下:①大鼠骨髓间充质干细胞、肌腱细胞分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow derived mesenchymal stem cells,r MSCs)的原代培养:全骨髓分离法体外分离提取SD大鼠r MSCs。倒置相差显微镜观察到r MSCs细胞形态均一,呈梭形或三角形,核质明显,集落呈旋涡状等。流式细胞仪对r MSCs细胞表面抗原鉴定结果显示,96.9%的细胞CD90阳性,92.9%的细胞CD44阳性,1.13%的细胞CD34阴性,检测结果符合间充质干细胞的基本特征。肌腱细胞的原代培养:用组织块培养法提取SD大鼠前脚趾肌腱,20天左右后进行传代培养。肌腱细胞形态呈长梭形纤维状形态、折光性强、细胞核明显。②r MSCs-CM对肌腱细胞增殖的影响课题组预实验表明,r MSCs-CM处理24 h、48 h和72 h对肌腱细胞的增殖均具有促进作用,但促增殖效果差异不大,故本课题主要针对r MSCs-CM处理24 h对肌腱细胞增殖的影响进行研究。采用细胞计数法研究发现,培养24 h后,r MSCs-CM处理组肌腱细胞数量显著高于对照组,约为对照组的1.5倍,细胞周期检测显示,r MSCs-CM处理组细胞的增值指数PI显著高于对照组,提示r MSCs-CM处理24 h能显著促进肌腱细胞增殖。③r MSCs-CM通过激活ERK1/2促进肌腱细胞增殖研究发现,r MSCs-CM处理15、30、60、90和120 min均能显著刺激肌腱细胞p-ERK1/2的表达,其中15min激活最强烈,表达量约为对照组的1.8倍(p<0.01),提示r MSCs-CM可能通过激活ERK1/2信号通路促进肌腱细胞增殖。ERK1/2的抑制剂PD98059(50μM)能显著抑制r MSCs-CM促进的肌腱细胞ERK1/2磷酸化。对肌腱细胞增殖情况的检测发现,PD98059能显著抑制r MSCs-CM促进的肌腱细胞增殖,肌腱细胞的增殖指数PI降低到对照组水平,提示r MSCs-CM通过激活ERK1/2促进肌腱细胞增殖。综上,本文的研究结果显示,r MSCs-CM通过激活ERK1/2信号通路影响肌腱细胞周期,进而促进肌腱细胞增殖。