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研究背景扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是临床上常见的一类致病原因复杂的心肌病。该疾病往往导致严重心力衰竭和心律失常引起的猝死。扩张型心肌病的病因很多比如病毒感染,自身免疫异常和中毒。而在过去几十年对患病家系的研究表明其中基因缺陷是DCM发病机制中的重要的一环。近年来有研究者发现一些编码心肌细胞骨架蛋白的基因突变导致的功能失衡,最终会引起DCM的发生。心肌肌小节Z线是由多个骨架蛋白组成,负责肌小节和肌小节之间力的传递。Z线不仅发挥重要结构上的功能,同时也是心肌细胞内重要的信号节点,接受心肌细胞外界机械力刺激产生的信号。ZASP(Z-band,alternatively Spliced PDZ-motif protein)位于肌小节的Z线上,是其中一个重要的细胞骨架蛋白,对应的基因是LDB3,这种基因的突变会导致扩张型心肌病的发生。Cypher基因(小鼠中对应的基因)在心肌中的敲除会导致心肌细胞功能紊乱以及最终致使DCM。前期我们的研究表明Cypher不仅在Z线上发挥结构方面的作用,还是PKA的锚定蛋白,但是缺失Cypher引起的心肌磷酸化蛋白谱的变化以及其具体作为锚定蛋白在信号传导中发挥的功能还未知。研究目的关于Cypher敲除后心肌内磷酸化蛋白谱的变化以及作为PKA锚定蛋白在信号通路中的具体作用不甚明了。本研究旨在宏观上探索Cypher敲除后心肌磷酸化蛋白谱的变化以及具体作为PKA锚定蛋白的下游未知蛋白以及与之的相互关系。研究方法1.首先利用非标记定量蛋白质组学技术对Cypher敲除小鼠和野生型小鼠心肌蛋白质进行检测,筛选出差异蛋白。2.对于差异蛋白进行一系列生物信息学分析比较,宏观上观察相关变化,筛选重要蛋白。3.对筛选出的重点蛋白在组织验蛋白表达量,磷酸化水平。4.组织和细胞水平上验证相互作用,细胞上研究Cypher过表达后的重点蛋白表达量,磷酸化水平。研究结果1.质谱鉴定到总共145个磷酸化蛋白共225个磷酸化位点发生有意义的变化(包括上调和下调)。2.Cypher敲除后心肌组织中磷酸化蛋白图谱从分子功能,细胞组分和生物学过程三方面看改变最明显的依次是离子结合蛋白(15.29%)细胞骨架构成(18.97%)以及DNA转录调控(17.65%)。而有趣的是在通路富集的分析中,细胞连接通路上改变显著(8.89%)。3.在心肌组织中Cypher敲除小鼠中的波形蛋白(vimentin)72位点的磷酸化水平都明显低于野生型小鼠,而蛋白表达量水平却显著高于野生型小鼠。4.HEK293细胞和H9c2细胞中过表达Cypher后波形蛋白72位点的磷酸化水平在PKA激动剂加入后明显升高及同时在HEK293细胞中过表达Cypher和vimentin后加入蛋白合成抑制剂后发现vimentin蛋白的半衰期比单独过表达vimentin要明显提前。结论1.在心肌组织中Cypher缺失可能不仅影响了细胞骨架的稳定,还对细胞连接产生作用。2.Cypher作为新的典型PKA锚定蛋白,对vimentin72位点的磷酸化水平起到增强作用;同时Cypher可以促进vimentin的降解。