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实验目的:抗病毒口服液为临床常用抗病毒中成药,具有清热祛湿、凉血解毒等功效。常用于风热感冒、温病发热、上呼吸道感染及流感、腮腺炎等病毒感染疾患。然而,由于缺乏合适的体内及体外活性评价模型,其抗病毒药效一直难以得到有效评价,作用机制也有待阐明。本课题在课题组前期工作基础上,我们采用拘束应激建立的流感病毒(H1N1)感染小鼠模型和应激激素皮质酮(CORT)建立的细胞易感性模型,研究抗病毒口服液对流感病毒易感性及流感继发性肺炎的作用,并深入探讨其作用机制,旨在建立和拓展适合中药药效的筛选与评价方法的共性技术,为中医药防治流感的研究提供科学依据。实验方法:本论文首先研究了抗病毒口服液对应激负荷小鼠流感病毒易感性的影响。将雄性昆明种(KM)小鼠随机分为正常对照组(Control),病毒对照组(Virus),病毒+拘束应激模型组(Restraint stress+Virus),病毒+拘束应激+阳性药达菲组(Restraint stress+Virus+30.8 mg/kg/d oseltamivir)(根据人的临床剂量150 mg/d折算),病毒+拘束应激+抗病毒口服液低剂量组(Restraint stress+Virus+12.3m L/kg/d KBD-L)(根据人的临床剂量30 mL/d折算),病毒+拘束应激+抗病毒口服液高剂量组(Restraint stress+Virus+24.6 m L/kg/d KBD-H)。实验组每天给药2次并连续给药7 d,空白对照组和病毒对照组灌服等体积的生理盐水。给药当天给予拘束应激22 h,用通风良好的50 mL尖底聚丙烯塑料离心管作为小鼠拘束装置,拘束期间小鼠禁食禁水,而对照组小鼠为非拘束但禁食禁水。小鼠拘束负荷22 h后恢复第1 d,将小鼠用乙醚轻微麻醉后以2×LD50的H1N1(A/FM/1/47)流感病毒液(35μL/只)滴鼻感染,对照组以等量PBS溶液滴鼻。从小鼠感染流感病毒后当天起,每天定时测定小鼠的体重,观察并记录各组小鼠的发病症状、发病时间、死亡时间,连续观察21 d。此外,另一批小鼠经同样的分组、给药、拘束应激和病毒感染等处理后,于病毒感染的第5 d乙醚麻醉处死,采集肺组织,H&E染色观察病理变化,检测流感病毒核蛋白(NP)的蛋白和基因表达水平、以及炎症因子白介素-1b(IL-1b)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的蛋白表达水平。其次,本论文研究和探讨抗病毒口服液调节流感病毒易感性的作用机制。实验动物分组及处理同上,所有小鼠在感染病毒的第5d,乙醚麻醉处死,收集肺组织,检测肺组织中干扰素-β(ifn-β)、干扰素诱导跨膜蛋白3(ifitm3)、线粒体融合蛋白2(mfn2)、线粒体抗病毒信号蛋白(mavs)、磷酸化干扰素调节因子3(p-irf3)、核转录因子-κb(nf-κb)的基因或蛋白表达水平。此外,小鼠在拘束后第3d,乙醚麻醉心脏取血,收集肺组织,检测小鼠血浆中cort含量和肺组织中mfn2和mavs的蛋白表达变化。最后,采用cort负荷a549细胞模型研究抗病毒口服液中的活性成分连翘苷、连翘酯苷a、芒果苷和(r,s)-告依春的抗病毒作用。将药物加入a549细胞预保护2h后,加入100μmcort作用48h,洗去药物后以10tcid50流感病毒感染a549细胞,收集细胞,提取蛋白,检测np、ifn-β和ifitm3的蛋白表达水平。实验结果:本研究结果显示抗病毒口服液高剂量组能够延长感染病毒后小鼠的发病时间、生存时间,并降低小鼠死亡率,提示该药对甲型h1n1流感病毒fm1株感染应激小鼠有保护作用。并且,抗病毒口服液能够降低感染流感病毒的拘束应激小鼠的肺指数,改善小鼠的肺水肿,有效地促进流感病毒的清除,减少tnf-α和il-1β的分泌,使局部病变组织炎症减轻,表明抗病毒口服液对流感病毒h1n1感染应激小鼠肺组织具有较好的保护作用。对其机制的初步研究结果显示抗病毒口服液对拘束应激小鼠血浆中cort水平无明显影响,但能显著地恢复拘束应激小鼠肺组织中mavs水平和降低mfn2蛋白表达;此外,抗病毒口服液能够升高流感病毒感染应激小鼠肺组织中mavs和p-irf3的蛋白水平,减少nf-κb的蛋白表达水平,从而增加ifn-β的mrna和蛋白水平,上调ifitm3蛋白表达。以上结果表明,抗病毒口服液中的活性成分不是通过中枢抗应激作用降低流感易感性的,而是通过其对线粒体抗病毒信号(mavs)通路的调节作用。根据高效液相(hplc)分析方法对抗病毒口服液中活性成分的定量结果,利用cort建立的细胞易感性模型对抗病毒口服液中主要单体成分进行抗病毒药效筛选,发现芒果苷、(r,s)-告依春、连翘苷和连翘酯苷a均能够通过增加ifn-β和ifitm3的表达,从而促进病毒的清除,减少了NP的水平。实验结论:抗病毒口服液中的活性成分通过抑制Mfn2的表达增强MAVS抗病毒信号通路促进IFN-β的分泌,抑制流感病毒的复制,同时通过下调NF-κB抑制炎症反应,从而降低应激小鼠对流感病毒的易感性。