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马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)属于反转录病毒科慢病毒属家族中的成员,该病毒通常感染马属动物如马、驴、骡等。EIAV与人类免疫缺陷病毒(HIV-1)等慢病毒属成员在病毒形态,基因组构成、复制分子机制以及与宿主的相互拮抗作用等方面都具有相似性。EIAV被认为是研究慢病毒致病机制的重要模型。现有研究认为EIAV是最简单的慢病毒,其基因组包括3个结构蛋白基因(它们分别编码Env蛋白、Gag蛋白和Pol蛋白)和3个附属蛋白基因(它们分别编码Tat蛋白、S2蛋白和Rev蛋白)。在本研究中,我们根据EIAV基因组转录特征,利用RT-PCR方法从EIAV感染马脾脏中扩增到一种新的mRNA转录本,并命名为s4。通过克隆后测序发现,该转录本的5’剪切供体位点和3’剪切受体位点与EIAV编码的其他转录本不同,它具有完整的开放阅读框,与EAIV env基因在同一个读码框内,并且与env的C末端重叠,我们将其编码蛋白命名为S4。通过RT-PCR的方法,我们在EIAV感染马匹的骨髓、肝脏、淋巴结、脑组织等多个组织以及EIAV感染的马外周血单核巨噬细胞中扩增到了s4特异性的转录本。在蛋白水平的验证发现,S4大小约18 kDa,表达分布于细胞浆。另外,我们利用抗S4多克隆抗体在感染了EIAV的马巨噬细胞中检测到了18 kDa大小的特异性条带,进一步表明S4存在于EIAV感染的细胞中。为研究S4在病毒复制过程中的生物学功能,通过反向遗传技术,构建S4表达缺失型EIAV感染性克隆。转染HEK293T细胞发现,S4缺失表达型EIAV在细胞上清中病毒粒子含量显著低于野生型EIAV;而过表达S4后,能显著增加细胞上清中野生型和S4表达缺失型EIAV病毒粒子量,并且呈剂量依赖性增加。表明S4可以调节EIAV的释放。天然免疫限制因子tetherin是一种干扰素诱导的跨膜蛋白,tetherin通过其特殊的拓扑结构限制病毒粒子从细胞膜释放从而发挥其广谱的抗病毒活性。前期研究显示,人源和马源tetherin可以限制EIAV的释放。为研究S4如何调节EIAV的释放,我们通过干扰和敲除HEK293T中的tetherin基因的表达,再转染S4缺失表达型EIAV感染性克隆,发现细胞上清中病毒粒子释放明显增多。另外,将S4和马源tetherin表达载体共转HEK293T细胞,发现S4可以拮抗马tetherin对于EIAV的限制作用,并且S4和tetherin可以相互作用。由此表明S4可以拮抗宿主限制因子tetherin从而促进病毒粒子的的释放。为解释S4拮抗tetherin的分子机制,我们将S4和tetherin表达载体共转HEK293T细胞,通过激光共聚焦显微镜观测和流式细胞术检测发现S4可以显著下调tetherin在细胞膜表面的表达,并通过影响其正向转运的方式将其限制于内质网和反面高尔基体中,但是S4不影响tetherin的内吞作用。综上所述,本研究首次发现了EIAV的一种新编码蛋白S4,该研究结果改变了对EIAV基因组结构的认识,证明EIAV应该至少含有4个附属蛋白,并证实了S4通过拮抗宿主蛋白tetherin的抗病毒活性促进EIAV释放,具有对抗宿主天然免疫反应的功能。