第一部分小鼠百草枯中毒诱导急性肺损伤和肺纤维化模型目的:百草枯（PQ）对人体有剧毒性且无特效解毒药,临床上以口服导致的急性PQ中毒为主,死亡率高。腹腔注射和灌胃法是构建动物PQ中毒模型最常用的方法。然而最终的模型效果受多种实验条件的影响。第一部分实验将就急性PQ中毒模型建立后,小鼠急性肺损伤（ALI）以及纤维化情况进行评估,旨在为后续实验建立一个较为稳定的PQ中毒后ALI和肺纤维化模型。方法:选取6-8周龄雄性Balb/c小鼠,禁食不禁水6小时后,以80mg/kg剂量给小鼠灌胃PQ溶液（100mg PQ标准品溶于10ml无菌双蒸水中）,对照组灌胃相同剂量无菌双蒸水,灌胃完成后继续禁食2小时后恢复饮食。灌胃后第3天,取肺组织检测小鼠PQ浓度,并通过观察小鼠肺部大体情况和苏木精-伊红（Hematoxylineosin,HE）染色评估小鼠早期肺部损伤情况;灌胃后第3、7、14、21天取肺组织通过Masson染色评估小鼠肺部纤维化情况。结果:Balb/c小鼠灌胃PQ溶液后第3天仍可在肺内检测到PQ信号。而且在灌胃后第3天,与对照组相比,染毒小鼠肺脏可见明显充血呈异常的深红色,肺组织HE染色可观察到WT-PQ组小鼠肺泡结构破坏,大量炎症细胞和红细胞浸润渗出。灌胃后第3、7、14、21天,Masson染色均可观察到小鼠肺泡结构破坏,肺间隔明显增厚,间质内蓝色胶原沉积显著增多,其中以第14天最为明显。结论:本部分实验成功构建小鼠PQ中毒诱导ALI和肺纤维化模型,且纤维化的高峰期在14天左右,因此本实验终点确定为灌胃后第14天,可为后续进一步研究PQ中毒后肺损伤的相关免疫机制提供合适的实验模型。第二部分严重联合免疫缺陷小鼠百草枯中毒后肺损伤显著减轻目的:百草枯（PQ）致肺损伤的具体分子机制仍未阐述完全,目前普遍认为与PQ诱导的氧化应激失控和炎症反应有关,但是临床上抗氧化和抗炎疗法的效果并未十分满意。研究表明免疫性相关机制在PQ中毒中发挥重要作用,然而关键性细胞以及具体的机制仍未完全明确。本部分实验旨在研究严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠PQ中毒后ALI和肺纤维化的发生情况,寻找发挥关键性作用的免疫细胞线索。方法:本实验分别建立Balb/c小鼠和SCID小鼠的PQ中毒模型,相应对照组灌胃相同剂量的灭菌双蒸水。使用质谱技术检测造模后72小时内染毒小鼠肺组织PQ浓度。观察各组小鼠造模后14天的生存状况。造模后第3天取材,通过肺的大体观、HE染色,透射电镜（TEM）观察评估小鼠ALI情况。造模后第3、7、14天取材,通过肺组织Masson染色和免疫组化（IHC）检测α-SMA表达水平评估各组小鼠肺纤维化情况。另外,我们采用免疫荧光检测肺组织ROS含量,采用TUNEL试验观察小鼠肺内细胞凋亡情况。结果:染毒后的3h、12h、24h、48h和72h,SCID小鼠和Balb/c小鼠的肺组织内PQ浓度基本一致,各时间点比较,差异无统计学意义（P值均大于0.05）。SCID小鼠染毒后14天的生存率（100%）明显高于Balb/c小鼠染毒后（64.29%,P=0.0154）。造模后第3天,肺脏肉眼观、HE染色和TEM观察结果显示,WT-PQ组小鼠肺脏大体呈异常的充血水肿;肺泡结构严重破坏,肺组织大量炎症细胞和红细胞渗出浸润;电镜下II型肺泡上皮细胞形态异常,胞质板层小体和线粒体数量明显减少,并且间质内已可见明显增多的胶原纤维;而SCID-PQ组小鼠无论是大体水平、病理显微水平或是电镜超微水平,肺部损伤均显著减轻。造模后第3、7、14天,WTPQ组的小鼠肺组织Masson染色显示肺泡结构破坏、肺间隔增厚以及胶原纤维显著沉积,而SCID-PQ组Masson染色未见明显异常,IHC结果显示WT-PQ组小鼠肺α-SMA的含量明显高于SCID-PQ组。ROS检测和TUNEL实验结果显示,与WT-PQ组相比,SCID-PQ组小鼠肺组织氧化应激水平和细胞凋亡水平均明显降低。结论:SCID小鼠PQ中毒后ALI和肺纤维化程度均显著减轻,且SCID小鼠PQ中毒后肺部氧化应激和细胞凋亡水平亦明显减轻。第三部分:CD4+T淋巴细胞转输后激发SCID小鼠百草枯中毒后肺损伤及其相关免疫机制探讨目的:前期大量研究证明CD4+T淋巴细胞参与多种原因诱导的肺损伤,包括PQ中毒。其中CD4+T淋巴细胞分泌的IL-17A是促进ALI和肺纤维化形成进展的重要细胞因子。本部分实验旨在通过评估过继转输CD4+T淋巴细胞的SCID小鼠PQ中毒后肺损伤的发生情况,检测脾脏及肺内CD4+T淋巴细胞比例和功能的变化,探讨PQ中毒后肺损伤的相关免疫机制。方法:腹腔注射转输野生型Balb/c小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞至SCID小鼠体内,并分别建立Balb/c小鼠、SCID小鼠和过继转输CD4+T淋巴细胞后SCID小鼠的PQ中毒模型。造模后第3天,通过肺的大体观、HE染色,TEM观察结果评估小鼠早期肺部损伤情况;造模后第3、7、14天取材,通过Masson染色和免疫组化（IHC）检测α-SMA表达量评估各组小鼠肺纤维化情况。采用免疫荧光和TUNEL试验分别检测肺ROS水平以及细胞凋亡情况。使用流式细胞技术检测染毒后小鼠脾脏和肺脏CD4+T淋巴细胞比例变化以及脾脏CD4+T淋巴细胞表面PD-1表达水平变化;WB检测脾脏CD4+T淋巴细胞内IL-17A和TGF-β1的表达水平,和肺组织TGF-β1表达水平,并使用免疫荧光技检测肺组织CD4IL-17A水平。结果:转输的CD4+T淋巴细胞可成功分布至SCID小鼠的外周血、脾脏和肺组织内。造模后第3天,转输CD4+T淋巴细胞后的SCID小鼠中毒后出现明显的肺损伤:肺脏表面充血,外观呈异常的深红色;HE染色显示肺内肺泡结构破坏,大量炎症细胞和红细胞浸润渗出;电镜结果发现肺泡的塌陷,II型肺泡上皮细胞形态异常,胞质内板层小体和线粒体数量明显减少,且间质内已有明显胶原纤维增多,与WTPQ组小鼠表现一致。造模后第3、7、14天取材,Masson染色显示SCID-Trans-PQ组小鼠肺间隔明显增厚,胶原纤维明显沉积,IHC结果显示染毒后的过继转输小鼠肺α-SMA表达量明显升高;与WT-PQ组结果一致。另外,SCID-Trans-PQ组小鼠染毒后肺内氧化应激和细胞凋亡水平也明显高于SCID-Trans-Control组和SCIDPQ组,与WT-PQ组结果一致。通过流式细胞技术发现PQ中毒后,Balb/c小鼠脾脏内CD4+T淋巴细胞前期比例无明显变化,第14天时比例出现降低,而CD4+T淋巴细胞上的PD-1表达量早期即明显增加,随后呈现降低趋势,14天时与对照组持平;脾脏CD4+T淋巴细胞内的TGF-β1和IL-17A蛋白在染毒后3、7、14天均明显升高。而肺内CD4+T淋巴细胞比例中毒早期明显升高,随后细胞比例呈逐渐下降趋势,14天时低于对照组。然而,染毒后小鼠肺组织内CD4阳性细胞分泌的IL-17A从第3天开始直至第14天,均明显高于对照组;另外,SCID-Trans-PQ组和WT-PQ组小鼠肺组织内的TGF-β1蛋白表达量明显高于其他组。结论:CD4+T淋巴细胞转输后激发SCID小鼠PQ中毒后ALI和肺纤维化,以及肺部氧化应激和细胞凋亡,提示CD4+T淋巴细胞在PQ中毒后小鼠肺损伤形成进展过程中发挥重要作用,可能与CD4+T淋巴细胞表面PD-1的上调以及IL-17A和TGF-β1蛋白生成增加有关。