原发性肝细胞癌(hepatacellular carcinoma,HCC)是全球第五位最常见的恶性肿瘤,在全球肿瘤患者的致死率中高居第三位,具有高死亡、高复发、预后差的特点,五年生存率不到10%。全球HCC的致病因素与全球各地区乙型和丙型肝炎的流行相关,中国目前是肝癌发病率最高的国家。目前用于HCC高危人群筛查的指标主要是血清甲胎蛋白和超声检查,但两者在HCC诊断早期均存在灵敏度不高的缺陷。大多肝癌患者确诊时已达晚期或发生转移,致死亡率居高不下,寻求高灵敏度和特异度的新型肝癌标志物具有重要意义。近年来随着糖组学的进展,异常糖基化修饰在肝癌研究中取得了长足的进步,为早期诊断标志物及发病机制的研究提供了新的依据。Callewaert等利用DSA-FACE方法获得HCC患者血清总蛋白N-糖图谱,发现在肝癌进展中血清蛋白的某些特征性糖结构出现改变,可用于监测肝纤维化、肝硬化(liver cirrhosis,LC)、肝癌的发生发展,并将此系列诊断应用命名为“肝病临床糖组学”。本实验室前期采用DSA-FACE、凝集素印迹、糖蛋白电泳等技术也对HBV相关肝病N糖组学特征性改变及其诊断应用、功能相关性等进行了系列研究探索。现有研究提示疾病中存在多种异常糖基化修饰方式的改变中,岩藻糖基化修饰改变的报道尤为引人注目。核心岩藻糖基化的甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein-L3,AFP-L3)在2005年被FDA采纳作为肝癌患者的诊断和预后指标,AFP-L3水平与肝癌分期及肝癌细胞生物学行为相关。除AFP-L3外,Comunale等鉴定出肝癌组和健康对照组血清中出现岩藻糖基化水平表达差异的蛋白20个左右,含免疫球蛋白分子和除免疫球蛋白之外的其它血清糖蛋白,其岩藻糖基化水平与肝癌细胞的生物学行为、肝癌的发生发展及预后相关,这些糖蛋白被认为是较有前景的肝癌标志物。血清胎球蛋白A蛋白是由肝脏分泌入血的负性急性时相蛋白,是天然的胰岛素受体抑制剂和全身性的异位钙化抑制剂,与人胰岛素抵抗、肝脂肪积聚有关。肝癌患者出现胰岛素代谢抵抗、糖代谢紊乱和钙磷代谢障碍,其机理即可能涉及胎球蛋白A分子。有研究显示血清胎球蛋白A水平降低是肝癌患者短期死亡的独立预测因素,与肝细胞功能失代偿有关。胎球蛋白A可通过钙离子介导与肿瘤细胞表面受体结合,促肿瘤细胞生长、抑制肝脏炎症发生和减少肝细胞凋亡,还可能作为重要的生长信号分子,参与癌细胞在血管内的转移和生长。本研究在本实验室前期大量有关肝病N糖组学系列研究的基础上,以血清中单个特定蛋白胎球蛋白A为主要研究靶分子,在临床水平研究其蛋白水平及其岩藻糖基化水平在乙型肝炎(Hepatitis B Virus,HBV)相关肝病中的表达改变和潜在诊断价值。第一部分：胎球蛋白A在HBV相关肝病血清和肝癌组织中的水平及临床意义本研究通过对HCC、LC和健康对照组的血清胎球蛋白A水平进行分析。收集144例HCC、LC、健康对照组血清(58例HCC、42例LC、44例健康对照血清),用ELISA检测各病例组的胎球蛋白A血清水平。研究发现LC组的血清胎球蛋白A水平明显低于HCC组和健康对照组(均为p<0.001)；HCC组血清水平与正常健康对照组间差异无统计学意义。其中胎球蛋白A血清蛋白水平和实验室指标总胆汁酸(total bile acid,TBA)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血酶时间(activeated partial thromboplastin time,APTT)、血小板(platelet,PLT)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)、间接胆红素(indirect bilirubin,IBIL)以及Child-Pugh分级等呈负相关,与实验室指标红细胞(red blood cell,RBC)、总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、白球比(albumin/globulin,A/G)、α-L-岩藻糖苷酶(a-L-fucosidase, AFU)、癌胚抗原199(Carcinoembryonic antigen199,CA199)、血红蛋白(haemoglobin,HGB)等呈正相关关系。通过检测肝癌患者癌组织和癌旁组织胎球蛋白A水平,获得胎球蛋白A蛋白在组织表达水平的特征性改变。收集26对肝癌患者的癌组织和癌旁组织,采用western-blot半定量检测癌组织和癌旁组织的的表达水平,研究发现肝癌患者癌组织的胎球蛋白A蛋白表达水平显著高于对应癌旁组织(P=0.002)。第二部分：凝集素酶联免疫吸附法检测岩藻糖基化胎球蛋白A的方法学建立本研究自行建立凝集素酶联免疫吸附法(Lectin-ELISA方法)进行血清岩藻糖基化胎球蛋白A水平的检测。本方法原理类似双抗体夹心ELISA,其中二抗使用糖蛋白结构特异性结合凝集素代替,即：使用胎球蛋白A抗体包被ELISA板,抓取样本中的抗原后,用特异性的凝集素识别抗原上的岩藻糖结构,用于检测岩藻糖基化抗原水平。通过条件优化确定包被抗体、标本稀释和特异性识别凝集素的最适工作浓度;由于无市售岩藻糖基化胎球蛋白A标准品,采用混合血清的一定倍比稀释梯度为样本标准品建立标准曲线；以重复性、最低检测限、交叉反应、血清胆红素、乳糜等评价该血清Lectin-ELISA的检测性能和抗干扰性。结果得到胎球蛋白A抗体和橙黄网胞盘菌凝集素(Aleuria aurantia lectin,AAL)的最佳工作浓度为1ug/ml和0.4ug/ml。该方法的最大批内和批间变异系数分别为6.91%和12.2%。最低检测限为1.95ng/ml,与人抗体IgG及与胎球蛋白A具有同源序列的cystain C蛋白无交叉反应。游离胆红素对该方法吸光度值有干扰影响,血清含游离胆红素的浓度越高,吸光度值越大。第三部分：岩藻糖基化胎球蛋白A在HBV相关肝病血清中的水平和诊断评价本研究应用Lectin-ELISA方法检测各组血清岩藻糖基化胎球蛋白A水平,通过分析HCC、LC、HBV无症状携带者、健康对照各组的血清岩藻糖基化胎球蛋白水平,探讨血清岩藻糖基化胎球蛋白A水平对HCC、LC的诊断价值。建模组收集144例HCC、LC、健康对照组血清,研究发现HCC组、LC组血清岩藻糖基化胎球蛋白A水平显著高于健康对照组。验证组收集122例HCC、61例LC、116例HBV无症状携带者和108例健康对照组血清,通过受试者工作曲线(ROC曲线),分析岩藻糖基化胎球蛋白A水平对HCC、LC的诊断价值。研究发现HCC组、LC组血清岩藻糖基化胎球蛋白A水平显著高于HBV无症状携带者、健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HBV无症状携带者和健康对照组岩藻糖基化胎球蛋白A水平差异无统计学意义。采用Cutoff值为1.12,鉴别LC组与HBV无症状携带者、健康对照组时,其ROC曲线下面积为0.906,95%可信区间为0.861～0.951。血清胎球蛋白A岩藻糖基化水平和实验室指标ALB、前白蛋白(Prealbumin, PALB)、TP、PLT、尿酸(uric acid, UA)、RBC、HGB等呈负相关,与丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)、AFP、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、CA199、癌胚抗原125(Carcinoembryonic antigen125,CA125)、DBIL、TBIL、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、γY-谷氨酰转移酶(Gamma-glutamyltransferase,GGT)、TBA、PT等呈正相关。