研究背景目前已报道的原发性肝癌(primary liver cancer,PLC,以下简称肝癌)相关标志物很多,细胞因子(cytokines,CKs)就是其中一大类。细胞因子是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质,通常通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学作用。研究表明,肝癌细胞高表达众多细胞因子,包括碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors,bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、中期因子(midkine,MK)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血小板衍生内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)等,其在肝癌患者血清中也明显升高,并且可能与肝内侵袭、转移、血行播散和预后不良有关,被认为可作为潜在靶分子用于肝癌诊断及治疗。其中bFGF、VEGF、HGF、MK和OPN同属于肝素结合性细胞因子。已知一种肿瘤可分泌多种肿瘤标志物,不同的肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型可有某种相同的肿瘤标志物,而且在不同的肿瘤患者体内,肿瘤标志物的质和量变化也较大。显然,单独检测一种肿瘤标志物,可能会由于测定方法的灵敏度不够而出现假阴性,联合检测多种可以互补的肿瘤标志物则能够提高检出的阳性率。多指标联合检测一般分为系列诊断实验(串联)和平行诊断实验(并联)。串联时因多个指标同时阳性才支持诊断,因此在提高特异性的同时,降低了敏感性;并联时只需一个指标阳性即可支持诊断,因此在提高敏感性的同时,降低了特异性。因此,多个指标联合检测(串联或并联)不可能同时提升敏感性和特异性,也无法使用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)分析。鉴于这些情况,我们考虑,如果把几个合适的指标(都可能具有诊断价值且含量相近)集合成一个指标进行检测,由于减少了检测指标的数目,并提高了测定阈,可能不仅能够大大方便工作与分析,而且能够同时显著改善检测的敏感性和特异性。研究目的在课题组前期实验的基础上,建立可检测一组靶细胞因子总量的电化学发光免疫检测方法,并进行详细的方法学考察及初步的临床应用研究,以期发展出一种优于联合检测的新的实验技术。其工作原理甚至可以直接被移植到其他实验设计,形成一个新的检测技术发展方向。采用建立的方法对肝癌、多种类型肿瘤、肝硬化、其他良性肝病等不同疾病患者及健康志愿者血清样本进行检测,包括检测部分患者术后第1天、第3天和第5天血清样本,分析其变化情况,为后续进一步临床分析、评价其在肝癌诊断及预后预测中的应用价值打下基础。方法1、采用抗体-肝素双夹心法检测一组肝素结合性细胞因子群总量,探讨其可行性。(1)采用酶联免疫法(双抗体夹心法)绘制5种肝素结合性细胞因子标准曲线,并检测、分析患者血清中的相应含量。(2)采用酶联免疫法(肝素-抗体双夹心法)绘制5种肝素结合性细胞因子标准曲线,并检测、分析患者血清中的相应含量。(3)采用石墨电极板载量的电化学发光免疫法(肝素-抗体双夹心法)检测标准品及血清中5种肝素结合性细胞因子总量。2、在肝素结合性细胞因子检测基础上引入pdgf、pd-ecgf两种细胞因子,筛选、确定几个合适的靶因子进行组合,采用电化学发光免疫法(双抗体夹心法)检测大样本量的组合靶因子总量,比较其与afp在肝癌诊断特异性和敏感性方面的差异,并检测部分患者术后第1天,第3天和第5天的血清样本,观察其变化情况。结果1、标准曲线结果表明,针对7种细胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk、opn、pdgf、pd-ecgf)的抗体对以及细胞因子标准品的工作性能良好(其标准曲线相关系数r均大于0.99)。2、7种细胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk、opn、pdgf、pd-ecgf)的抗体对用于检测肝癌、肝硬化、良性肝病、其他类型肿瘤及健康者血清的工作性能良好,绝大多数样本检测值都能落在标准曲线的浓度范围内。3、采用抗体-肝素双夹心elisa法检测单个肝素结合性细胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk、opn)时,结果普遍偏低。原因可能是肝素与细胞因子结合的特异性差于抗体与抗原结合,肝素结合位点有限等。4、采用抗体-肝素双夹心elisa法检测一组肝素结合性细胞因子(bfgf、vegf、hgf、mk)时,当肝素浓度为10μg/ml时,混合检测所得值与单个检测之和相近;当肝素浓度>10μg/ml时,标准对照中od值升高不明显,但血清样本od值仍不断升高,甚至部分样本计算所得浓度超过双抗体夹心法所得浓度,可能原因是肝素捕获了某些未被洗涤的非目标肝素结合分子而导致的非特异染色。5、采用电化学发光免疫法检测HGF、MK、PDGF等3种因子总量时,3种因子组合总量或者单独检测每一因子后数值相加所得总量都呈现直线相关,无论浓度与信号都能一一对应,说明对应96孔石墨电极板载量完全能够满足3种抗体混合包被,并且证实混合抗体检测多因子总量的可行性。6、采用电化学发光免疫法检测部分临床样本的结果显示,肝癌组与肝血管瘤或肝内胆管结石等良性肝病组及正常人之间HGF、MK、PDGF等3种因子总量具有显著差异(P<0.05),但是肝癌组与其他类型肿瘤组之间无显著差异(P>0.05)。7、对比分析97例良恶性肝病患者(72例肝癌患者和25例良性肝病患者)血清中HGF、MK、PDGF等3种因子总量与AFP在特异性和敏感性方面的差异结果显示,血清中3种因子总量检测有助于肝癌诊断(ROC曲线下面积分别为0.8)。8、分析97例良恶性肝病患者(72例肝癌患者和25例良性肝病患者)手术前后血清中HGF、MK、PDGF等3种因子总量结果显示,术后第1天,第3天和第5天,肝癌患者血清3种因子总量持续下降,良性肝病患者术后血清中3种因子总量下降则不明显。这为我们后续进一步探讨一组靶细胞因子总量为一个检测指标在肝癌诊断及预后预测中的应用研究打下了基础。结论建立的电化学发光免疫法用于检测HGF、MK、PDGF等3种细胞因子总量简单实用,有用于肝癌辅助诊断、疗效监测及预后判断的潜能。3种靶分子在多种类型肿瘤患者血清中也有升高,可能兼具多种类型肿瘤的临床应用潜能,有待进一步进行双盲验证、规模化验证以及术后长期随访对比分析。由于3种目标分子没有统一的参考物质和参考检测方法,以及各生产商使用的标准品及抗体组成存在差异,检测方法标准化是一技术挑战,可能会限制临床转化应用的进程。