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目的:
明确LGR4基因敲除的成年小鼠眼部存在的特异性畸变及眼功能异常,为明确LGR4基因在小鼠视觉系统疾病中的作用及其与视觉系统发育缺陷的联系提供一定的实验基础。
方法:
由LGR4杂合子小鼠(LGR4+/-)繁殖得到野生型小鼠(LGR4+/+)及LGR4基因敲除小鼠(LGR4-/-),PCR.确定基因型,饲养至8周龄时作为实验对象,以同窝LGR4+/+小鼠为LGR4-/-小鼠的对照组。通过LaeZ染色法确定LGR4受体在小鼠眼部的表达部位:使用酚红棉线测量小鼠眼表泪液量、红外偏心摄影验光仪测量小鼠的眼屈光状态、角膜曲率计(附加+20D)测量小鼠相对角膜曲率半径、裂隙灯显微镜观察小鼠眼前节,比较LGR4+/+小鼠与LGR4-/-小鼠的眼睛是否存在功能上的不同;通过石蜡切片HE染色观察并测量LGR4+/+小鼠与LGR4-/-小鼠眼球前房角大小、视网膜神经纤维层厚度及计数单位长度神经节细胞数量,确定LGR4-/-小鼠眼部是否存在解剖上的畸变。
结果:
1.LacZ染色法确定LGR4受体在小鼠眼部的表达部位
LGR4受体在小鼠眼部多个组织包括睫状上皮、晶体皮质、神经节细胞层、内核层、外丛状层、外界膜等均有明显表达。
2.酚红棉线测量小鼠眼表泪液量
B6背景LGR4-/-与LGR4+/+小鼠的眼表泪液量,右眼分别为(5.85±1.29)mm/30s和(6.00±2.84)mm/30s,左眼分别为(6.10±0.84)mm/30s和(5.82±2.24)mm/30s,均无显著性差异;CD1背景LGR4-/-与LGR4+/+小鼠的眼表泪液量,右眼分别为(7.18±2.72)mm/30s和(6.522.06)mm/30s,左眼分别为(6.952.15)mm/30s和(5.62±1.93)mm/30s,右眼和左眼统计学分析显示分别为P>0.05和P<0.05。
3.红外偏心摄影验光仪测量小鼠的眼屈光状态
B6背景LGR4-/-与LGR4+/+小鼠的屈光状态,右眼分别为(6.20±8.65)D和(9.43±8.08)D,左眼分别为(7.56±9.23)D和(9.69±6.55)D,均无显著性差异;CD1背景LGR4-/-与LGR4+/+小鼠的屈光状态,右眼分别为(6.27±9.80)D和(0.87±9.09)D,左眼分别为(10.62±6.11)D和(1.16±10.66)D,统计学分析显示分别为P<0.05和P>0.05。
4.角膜曲率计(附加+20D)测量小鼠相对角膜曲率半径
B6背景LGR4-/-与LGR4+/+小鼠的相对角膜曲率半径及CD1背景LGR4-/-与LGR4+/+小鼠的相对角膜曲率半径,均显示LGR4-/-小鼠相对角膜曲率半径小于同窝LGR4+/+小鼠,P<0.05,差异有显著性。
5.裂隙灯显微镜观察LGR4-/-小鼠眼前节
裂隙灯显微镜下看到LGR4-/-小鼠眼部出现小眼畸形、角膜溃疡、角膜大疱、虹膜粘连、瞳孔移位、房角变窄、白内障等眼前节发育不良(Anteriorsegmentdysgenesis,ASD)的改变。
6.石蜡切片HE染色观察LGR4-/-小鼠眼部是否存在解剖学畸变:
石蜡切片显示LGR4-/-小鼠的角膜、房角结构和视网膜均有明显改变,眼前节变化类似ASD。观察到的LGR4-/-小鼠角膜病变包括基质紊乱、新生血管、中性粒细胞浸润、角膜大疱等,发生机率为65.38%(17/26);虹膜及房角结构改变包括虹膜前粘、房角关闭、瞳孔移位等,发生机率为61.53%(16/26);视网膜病变包括神经节细胞排列紊乱、视网膜充血等,发生机率为73.08%(19/26)。
7.石蜡切片上测量LGR4-/-与LGR4+/+小鼠前房角度、视网膜神经纤维层厚度,计数单位长度神经节细胞数量并比较
测量结果显示相较于LGR4+/+小鼠,LGR4-/-小鼠前房角度明显变小,视网膜神经纤维层厚度变薄,单位长度神经节细胞数量增加,差异均有显著性。
结论:
LGR4受体在小鼠眼部有广泛表达,在敲除LGR4基因后,小鼠的眼球多个组织出现明显发育缺陷及病理改变,表明LGR4基因在小鼠眼球发育过程及功能维持上有着重要作用,LGR4基因的缺失可以导致ASD。LGR4-/-小鼠眼后节视网膜亦有明显改变,主要影响神经节细胞数量和神经纤维层厚度,与涉及ASD的发育性青光眼似有关联,尚待进一步研究确定。