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药物递送始终是药学研究中一个十分重要的问题,合理、高效的药物递送系统可以显著改善药物的生物利用度、提高药物的治疗指数、降低药物的毒副作用并减轻病人的痛苦。20世纪80年代末、90年代初纳米技术的出现为药物递送提供了新的选择,纳米药物递送也引起了广大药学研究者的兴趣,成为药学研究领域的一个热点。纳米药物递送系统有很多优势,如可以将药物递送到难以到达的组织和病变部位、可以实现位点专一性靶向递送、实现药物的细胞内递送等。目前已经有多个纳米粒药物递送系统的药剂获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准,然而位点专一性的靶向纳米粒药物递送系统却停滞不前,目前仍然处于实验研究阶段。其中的一个重要问题是靶向效率不高,靶向纳米粒表面结合行为的评价在靶向纳米粒药物递送系统研究中起着关键作用,故建立一个简单、有效、高灵敏度的研究系统来研究和评价靶向纳米粒体外靶向结合行,为设计开发并筛选出高效靶向纳米粒药物递送系统提供技术支持,具有重要的学术价值和潜在应用前景。
本文基于常规的表面等离子体生物传感器(Surface Plasmon Resonance,SPR)原理,设计出宽角度扫描、高灵敏度的的SPR仪--SPR-Navi,基于SPR对表面介质折射指数高度敏感以及石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)对表面质量高敏感的特征,构建了一个简单、高效、高灵敏的研究和评价靶向纳米粒靶向表面结合行为的研究系统。其中涉及从SPR仪设计、测试,到SPR和QCM芯片的表面修饰(Langmuir-Blodgett(LB)膜修饰或/和自组装膜修饰)及膜结构特征研究新方法的建立,到表面膜系统的功能化的整个研究系统的建立,再到研究系统用于模型靶向纳米粒--生物素靶向脂质体的体外靶向表面结合行为研究。最终,为纳米薄膜的物理参数(如厚度、折射指数等)的测定和靶向纳米粒药物递送系统的体外靶向表面结合等生物物理学行为研究提供新的技术和方法。本文研究获得的主要结果和结论如下:
①SPR-Navi的设计和实验测试实验测试表明,SPR-Navi具有宽角度扫描范围(40-78°),对空气中的干样品和液体中的湿样品均有稳定的表现；高灵敏度并兼具角度扫描和固定角度两种测定模式,但固定角度测定的灵敏度高于角度扫描模式,其最低检测限(LOD)达到10-6数量级；方便灵活的芯片处置系统,可以芯片功能化后插进仪器进行测定或仪器上原位功能化。
②LB膜有序性的SPR探测1)建立了双介质(空气和水)SPR法同时测定硬脂酸(SA)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)LB膜厚度和折射指数的方法,并对比了pH对SA LB膜和表面压对DPPC LB膜厚度和折射指数的影响,结果显示SALB膜的厚度和折射指数均为30 mN/m大于7.5 mN/m,而SALB膜的厚度pH6仅略大于pH2,折射指数pH6大于pH2。
2)建立了双介质和双波长SPR相结合的薄膜的厚度、折射指数和色散关系三个参数物理参数同时测定新方法,同时测得了pH6下沉积获得的硬脂酸镉LB(CdSA LB)膜厚度、折射指数和色散关系三个参数。
3)DPPC和SA LB膜的掠角反射红外光谱(IRRAS)测定结果表明,LB膜的有序性DPPC30 mN/m大于DPPC7.5 mN/m,SA pH6大于SA pH2。
4)对比来自IRRAS的膜的有序性和来自SPR膜的折射指数,获得了一个规律,即更有序的LB膜有更大的折射指数或更大折射指数的LB膜更有序。基于此规律,建立了一个更简单快捷的判别LB膜有序性的方法,即通过SPR测定获得的LB膜的折射指数来定性比较由相同材料构成的LB膜的有序性。
③体外剪切流状态下靶向脂质体靶向结合行为的研究:SPR和QCM结合分析1)通过硫醇在金表面的自组装形成单层膜方法,对SPR和QCM芯片表面进行了修饰,SPR的实时监测、接触角测量及SAM的双介质SPR测定均表明了硫醇自组装膜在金表面的形成。并利用Streptavidin和Biotin之间强烈的亲和相互作用将生物识别分子Streptavidin固定在芯片表面,同时PEG化硫醇的使用和BSA处理避免了功能化芯片的非专一性相互作用。建立了本课题基于SPR和QCM的靶向纳米粒表面结合行为的研究系统。
2)Streptavidin和Biotin的相互作用:QCM监测获得了专一性结合的Streptavidin层的累积面密度和厚度分别为2.591 ng/mm2和2.591 nm；SPR测定获得了Streptavidin-Biotin相互作用的动力学结合速率常数ka为6.3×107；流速影响实验结果表明,流速对最终的Streptavidin层的累积厚度略有影响,而且流速对前三个浓度的Streptavidin结合影响明显,前边进样结合的Streptavidin影响后续Streptavidin结合；SPR动力学常数测定表明流速对结合速率常数ka的影响不大,但解离速率常数kd有一定的影响。
3)Biotin-Liposome结合的QCM测定同时定量获得了结合的脂质体层的厚度以及反应脂质体层力学特性的粘弹性,QCM测得的能量耗散变化表明形成的脂质体层为粘弹性层而非刚性膜,进一步也证明脂质体未发生融合。最终的脂质体层的累积厚度约40 nm,远小于脂质体的粒径126 nm,表明结合在芯片表面的脂质体由多个配体共同连接,导致脂质体存在一定的变形。
4)建立了脂质体与靶向表面结合的动力学常数的SPR测定方法。
5)流速对Biotin-Liposome结合的影响:流速对脂质体层厚度的影响显著,开始随着流速的增加厚度增大,50μl/min出现拐点,流速继续增加脂质体层的厚度反而减小,而且流速对低生物素含量的脂质体影响要大于高生物素含量；SPR测得的结合速率常数ka显示100μl/min大于10μl/min。
6)脂质体中生物含量对Biotin-Liposome结合的影响:QCM测得的脂质体层厚度结果表明,高生物素含量脂质体层的厚度明显大于低生物素含量,；SPR测得动力学结合速率常数ka也是0.635％Biotin大于0.01％Biotin,与厚度结果一致,表明高生物素含量有利于脂质体的结合。
7)粒径对脂Biotin-Liposome结合的影响:QCM测定显示脂质体层的厚度大粒径大于小粒径,而来自SPR的动力学结合速率常数ka大粒径小于小粒径,两个结果似乎矛盾,推测其因为在于粒径本身对脂质体层厚度的贡献所致。综合考虑,大粒径不利于脂质体的结合。
8)脂质体表面聚乙二醇(PEG)含量对Biotin-Liposome结合的影响:QCM测得的脂质体层厚度0％PEG>1.00％PEG>2.58％PEG,而SPR测得的结合速率常数ka0％PEG<1.00％PEG>2.58％PEG,如果考虑到0％PEG含量脂质体较其他两个有较大的粒径,对脂质体层厚度有一定贡献,综合结果表明PEG含量为1.00％的脂质体较0％和2.58％更易与靶向表面结合。
9)实验研究证明,本文构建基于SPR和QCM技术的研究系统是一个开展靶向纳米粒体外表面靶向结合行为研究的有力工具。