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目的建立大鼠颈椎间盘退变模型,研究其病理变化机制;阐明益气化瘀补肾方及拆方调控椎间盘退变的机理,探讨各方之间的差异性和协同性,研究中医气血、脏腑理论在延缓椎间盘退变中的作用。
方法通过手术破坏大鼠颈后部肌肉、韧带,建立动、静力失衡性颈椎间盘退变模型。运用组织病理学、组织形态学观察椎间盘细胞形态和营养供应;电镜技术、TUNEL法和流式细胞仪术研究椎间盘细胞凋亡机理;免疫组化法、化学比色法和ELISA法研究椎间盘VEGF、PLA2和PGE2的变化;RT-PCR法检测椎间盘ECM的变化;采用基因表达谱芯片研究椎间盘细胞信号传导通路。
结果1.光学显微镜下观察,3月造模组大鼠颈椎间盘开始出现退行性变化,关节软骨钙化层增厚,软骨下血管明显减少;5月模型组髓核完全纤维化,纤维环板层状结构消失,血管芽稀少,血管壁充血曲张;7月模型组与5月模型组相似,并发现部分椎体边缘骨赘形成。益气化瘀补肾方及拆方可以增加血管芽数量,减轻血管充血,减缓软骨终板的钙化进程。
2.透射电镜观察,3月造模组大鼠椎间盘细胞器稀少,可见到凋亡小体。5、7月模型组椎间盘组织中细胞较少,基质中胶原纤维断裂,可见较多坏死空化的细胞。TUNEL和FCM检测发现模型组椎间盘细胞凋亡率增高,益气化瘀补肾方及拆方可以降低椎间盘细胞凋亡率。3.与对照假手术组比较,模型组VEGF表达均增强(p<0.01),5、7月模型组VEGF表达更加明显;模型组椎间盘PLA2和PGE2含量增高,具有统计学意义(p<0.01);益气化瘀补肾方及拆方可降低退变椎间盘中VEGF表达、降低PLA2和PGE2含量。
4.对照假手术组比较,模型组Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅹ型胶原和MMP-13mRNA的表达增强(p<0.01);7月模型组TIMP-1mRNA表达降低(p<0.01)。益气化瘀补肾方及拆方可降低椎间盘细胞Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅹ型胶原和MMP-13mRNA的过度表达。
5.4号(模型组)芯片与其它芯片的差异最大,2号(益气补肾组)和3号(化瘀补肾组)结果最接近。五张芯片通过聚类可归为两类:①1号(益气化瘀组)、2号、3号芯片为一类;②4号和5号(益化补组)芯片为一类。三例以上差异表达的基因共有96条,如:磷脂酰肌醇蛋白激酶Pik3c3在用药组表达上调,模型组表达下调。
结论1.建立了动静力失衡性大鼠颈间盘退变模型,并观察到模型组大鼠颈椎间盘出现典型的退变形态学变化、细胞凋亡率增高、PLA2含量及VEGF表达增高。Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅹ型胶原及MMP-13mRNA表达均增强,TIMP-1mRNA表达降低。
2.益气化瘀补肾方及拆方可以不同程度延缓模型大鼠颈椎间盘的形态学退变过程、降低椎间盘细胞凋亡率、抑制间盘组织炎症反应、调节ECM代谢紊乱。各项实验指标的统计结果表明:各拆方之间存在着差异性,益气补肾方和化瘀补肾方对细胞凋亡指标作用最强;益气化瘀方对形态学和抑制炎症介质指标作用最强;益气化瘀补肾方较各拆方影响的指标更多,作用更明显,充分体现了三法,三方组合的优势。
3.用药组芯片与模型组芯片基因表达存在着差异,益气化瘀补肾方及拆方可调控细胞内信号传导类基因如:上调Pik3c3、PTK、ERK3、PHK1B1等的表达。