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2-酮基-D-葡萄糖酸是用于食品工业中合成D-异抗坏血酸及D-异抗坏血酸钠的重要前体。D-异抗坏血酸钠又称异Vc,是重要的抗氧化剂和食品添加剂,其防腐效果比Vc显著,且价格不到Vc的一半,具有重要的产业应用前景。生产2-酮基-D-葡萄糖酸的主要方法有:酶法、化学合成法和微生物发酵法,其中微生物发酵法是目前国内外普遍使用的方法。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobactersuboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,是生产葡萄糖酸、Vc等的重要工业菌种。Gluconobacter suboxydans能将葡萄糖经过以下两步氧化还原反应获得2-酮基-D-葡萄糖酸:PQQ依赖型的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,EC 1.1.5.2,GDH)是催化葡萄糖生成葡萄糖酸的关键酶,FAD依赖型的葡萄糖酸-2-脱氢酶(gluconate 2-dehydrogenase,EC 1.1.99.3,GA-2-DH)是催化葡萄糖酸生成2-酮基-D-葡萄糖酸的关键酶。将Gluconobacter 12(简称J12)进行菌种基因改造,对获得可产业化显示的遗传资源具有重要意义。本论文采用同源重组技术,以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵产量为目标,构建打靶片段,敲除J12上控制旁路代谢关键酶的基因gldh和sdh,加倍合成2-酮基-D-葡萄糖酸的关键基因gdh和ga-2-dh,得到2-酮基-D-葡萄糖酸产量提高的突变株,并通过显色反应和高效液相色谱法(HPLC)检测突变菌株的发酵产物。主要结果如下:(1)利用反向代谢工程设计,构建了葡萄糖脱氢酶基因敲除的打靶片段,电转化到J12感受态细胞,经四环素抗性验证和分子验证获得gdh-突变株。显色反应结果表明:gdh-突变株的葡萄糖脱氢酶催化活性减弱,说明gdh编码的PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶是催化葡萄糖生成葡萄糖酸的关键酶。(2)利用反向代谢工程设计,构建了葡萄糖酸-2-脱氢酶基因敲除的打靶片段,电转化到J12感受态细胞,经四环素抗性验证和分子验证获得ga-2-dh-突变株。显色反应结果表明:ga-2-dh-突变株的葡萄糖脱氢酶催化活性减弱,说明ga-2-dh编码的FAD依赖型葡萄糖酸-2-脱氢酶是催化葡萄糖酸生成2-酮基-D-葡萄糖酸的关键酶。(3)构建了gdh置换gldh的打靶片段,电转化到J12感受态细胞,经庆大霉素抗性验证和分子验证获得gdh+gldh-突变株。显色反应结果表明:gdh-gldh-突变株比J12催化效果略微明显;发酵60 h后HPLC检测结果表明:突变株不如J12的2-酮基-D-葡萄糖酸产量高,J12和突变株的2-酮基-D-葡萄糖酸产量分别为29.4 g/L、25.8 g/L。说明突变株中gdh基因加倍后,并没有使2-酮基-D-葡萄糖酸产量高于野生型。(4)构建了ga-2-dh置换sdh的打靶片段,电转化到gdh+gldh-感受态细胞,经四环素抗性验证和分子验证获得gdh+ga-2-dh+gldh-sdh-突变株。显色反应结果表明:gdh+ga-2-dh+gldh-sdh-突变株比J12的催化效果明显;发酵60 h后HPLC检测结果表明:野生菌株J12的2-酮基-D-葡萄糖酸产量为29.4g/L,而突变株的2-酮基-D-葡萄糖酸产量可达36.8 g/L,突变株中gdh基因和ga-2-dh基因均加倍后能提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量。