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第一部分 Thy-1肾炎大鼠肾组织(体内)和体外用sublytic C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMC)诱导转录因子KLF6与趋化因子(MCP-1 和 Rantes)的表达目的:检查Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)大鼠肾组织(体内)和体外用亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)产生转录因子 kruppel 样因子 6(kruppel like factor 6,KLF6)以及趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)和正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,Rantes)的基因表达水平和表达时相,分析上述因子产生之间的相关性。方法:复制大鼠Thy-1N模型,同时体外培养大鼠GMC并给予sublytic C5b-9 刺激,通过 Real-time PCR、Western blot 及 ELISA 检査 Thy-1 N 发病不同时间点的肾组织及不同处理的GMC中KLF6、MCP-1和Rantes的基因表达情况。结果:Thy-1N发病大鼠的肾组织中,KLF6的蛋白表达水平在5h到达峰值,MCP-1和Rantes的蛋白分泌水平在实验6h时均显著上调。此外,体外用sublytic C5b-9刺激培养的GMC,KLF6的蛋白表达在刺激后3h显著增多,而MCP-1和Rantes的分泌水平在5h明显上升。结论:Thy-1N大鼠的肾组织及受sublytic C5b-9刺激后GMC产生KLF6、MCP-1和Rantes的均显著增加,且KLF6升高时相略早于MCP-1和Rantes。提示,大鼠Thy-1N发病时,受sublytic C5b-9刺激的GMC可明显上调转录因子(KLF6)和趋化因子(MCP-1和Rantes)的基因表达,且这些因子之间可能存在着一定的关系。第二部分KLF6调控sublytic C5b-9刺激GMC诱导趋化因子MCP-1和Rantes转录与表达目的:研究转录因子KLF6对sublytic C5b-9刺激GMC诱导趋化因子(MCP-1和Rantes)的调控作用,并筛选KLF6在MCP-1和Rantes基因启动子上可能的结合区域。方法:首先,应用分子克隆技术构建KLF6过表达质粒(pIRES2-KLF6)以及KLF6发夹状小干扰RNA(shRNA)真核质粒。然后,将上述质粒分别转染GMC后再行sublytic C5b-9刺激,用Real-time PCR和ELISA检查过表达或沉默KLF6基因后对sublytic C5b-9刺激GMC诱导MCP-1和Rantes生成的影响。之后,用分子克隆技术构建MCP-1和Rantes基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-MCP-1-FL与pGL3-Rantes-FL),转染GMC后行荧光素酶报告基因实验(luciferase reporter assay),检查sublytic C5b-9刺激的 GMC上调MCP-1 和 Rantes基因启动子的活性及KLF6过表达或沉默对上述两基因启动子活性的影响。然后,用生物信息学软件预测MCP-1和Rantes基因启动子上KLF6潜在的结合位点,并据此分别构建出4个相应基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(pGL3-MCP-1-1～4 与 pGL3-Rantes-1～4)。将上述 MCP-1 和 Rantes 基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒分别转染GMC,再行荧光素酶报告实验测定sublytic C5b-9刺激及KLF6过表达对GMC上调MCP-1和Rantes基因启动子活性的影响。最后,用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验确证大鼠MCP-1和Rantes基因启动子上KLF6的结合部位。结果:(1)KLF6过表达能显著增加GMC中MCP-1和Rantes的mRNA和蛋白水平以及相应基因启动子活性,而沉默KLF6基因可明显抑制sublytic C5b-9刺激GMC诱导MCP-1和Rantes基因表达及其基因的启动。(2)pGL3-MCP-1-FL、pGL3-MCP-1-1～4分别给予sublytic C5b-9刺激或与过表达KLF6共转染GMC后,pGL3-MCP-1-4的启动活性显著降低。同样,pGL3-Rantes-FL、pGL3-Rantes-1～4分别给予sublytic C5b-9刺激或与过表达KLF6共转染GMC后,pGL3-Rantes-4的启动活性显著降低。(3)大鼠MCP-1基因启动子上-297nt～-123nt区域和Rantes基因启动子上-343nt～-191nt区域均存在KLF6的结合位点。结论:在sublytic C5b-9刺激的大鼠GMC中,转录因子KLF6能够直接与MCP-1和Rantes基因近端启动子结合,进而增强MCP-1和Rantes基因的启动,最后促使了趋化因子MCP-1和Rantes的基因启动、转录与表达。