宫颈癌是最常见的女性肿瘤之一,其发生与人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV),尤其是HPV16,18 感染密切相关。目前基于HPV16 的治疗性疫苗针对的靶蛋白主要为早期蛋白E6 或E7,这些疫苗有一定的疗效。但最近的研究也发现:机体对高危型HPV 病毒(HPV16、HPV18)E6、E7 蛋白的免疫反应与病变的自行消退没有必然联系,这或许是因为E6、E7 的高表达是在晚期病变组织中,而在感染初期和宫颈上皮瘤发生的早期,它们的表达被E2 蛋白抑制了。相反,E2 蛋白作为病毒DNA 复制和基因表达的主要调控蛋白,在感染初期和宫颈上皮瘤早期呈稳定稳定,且丰度较高。由此可以设想:若以HPV16 E2 蛋白为靶点,或许能够在HPV16 所致疾病的早期及时阻断病变的进一步发展。基于以上假设,我们设计了本研究课题。细胞毒性T 细胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL)在机体抗肿瘤和抗病毒的免疫过程中担负重要角色,在抗原刺激和相应的细胞因子诱导下,能够迅速增殖、分化,执行特异性杀伤功能,是设计治疗性疫苗的理论基础。设计HPV16 E2 相关疫苗,诱导针对该蛋白的特异性CTL 活化,阻断HPV16 所致病变,将成为新的治疗方法。完整的HPV16 E2 蛋白除包含CTL 表位外,还包含了B 细胞表位、Th 细胞表位等多种表位,若以完整蛋白做为治疗性疫苗,一方面使表位的针对性不强,另一方面, “免疫偏离”(immune deviation)、“免疫反转”(immune subvertion)等现象均提示:这些表位间可能相互抑制,导致抗原性消减。所以,仅以E2 蛋白CTL 表位为基础,设计制备的治疗性疫苗效果可能会更好。基于此思想,本文从HPV16 E2 蛋白的CTL 表位设计出发,体外诱导特异性CTL,同时构建表达E2 蛋白的靶细胞模型,最后评估该特异性CTL 对靶细胞的杀伤效应。本研究主要由三部分组成: 第一部分HPV16 之E2 蛋白CTL 表位的分析、多肽合成与鉴定基于量化基序法确定E2 蛋白的CTL 表位,选取结合系数最高的2 条九肽和1 条十肽作为候选表位。三条多肽由上海吉尔生化有限公司采用Fmoc 固相合成法合成,多肽合成的收集峰图和分子量质谱分析均提示多肽纯度高、质量好。第二部分质粒pIRES2-HPV16 E2-EGFP 的构建、鉴定及其在Caski 细胞中的表达即表达E2 蛋白的靶细胞模型的构建:以含有人HPV16 全基因组的质粒