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目的关节软骨退变主要是由于细胞外基质的降解,而基质的破坏主要是因为聚蛋白多糖的降解。聚蛋白多糖酶属于金属蛋白酶ADAMTS家族,通过裂解聚蛋白多糖球间域的Glu(373)-Ala(374)位点来促进聚蛋白多糖的降解。聚蛋白多糖酶-1(ADAMTS-4)和聚蛋白多糖酶-2(ADAMTS5)在降解关节软骨聚蛋白多糖中起关键作用。FN在RA和OA的关节滑液和滑膜中均有表达,在RA滑膜中FN的表达尤为丰富,它的代谢可能参与了软骨的降解,已有研究发现FN的碳末端能够与ADAMTS-4的碳末端结合,结合后ADAMTS-4的聚蛋白多糖酶活性被FN抑制,且抑制作用呈剂量依赖性。ADAMTS-4的聚蛋白多糖酶活性被FN抑制是可能是通过两者之间的碳末端相互作用实现的,聚蛋白多糖的降解过程存在某种FN参与的细胞外调节机制。PADI4是PAD家族中的成员,PADI4可修饰翻译后的肽基精氨酸,将其转换为瓜氨酸,此过程即瓜氨酸化,一些蛋白质被瓜氨酸化后其结构及活性会发生改变。本研究的目的是通过观察聚蛋白多糖酶1(ADAMTS-4)与纤维连接蛋白(FN)以及瓜氨酸化的FN (cFN)的结合活性及结合后的酶解活性,探讨ADAMTS-4的活性调节机制。材料和方法带有肝素结合域的分子量为的40kDaFN片段提纯自糜蛋白酶消化的人血浆白蛋白,购自Millipore公司,此FN片段包含纤维连接蛋白的CS-1肝素结合域,与ADAMTS-4具有高结合活性。兔源PADI4购自Sigma公司,93kDa的全长ADAMTS-4蛋白由Origene公司制备,缺失碳端的53kDa的重组ADAMTS-4蛋白购自R&D公司,此蛋白自催化区开始到间隔区停止(Phe213-Cys685)。抗ADAMTS-4碳端、氮端、肽段多抗以及抗瓜氨酸多抗购自Abcam公司。测定ADAMTS-4酶解活性的聚蛋白多糖酶活性分析试剂盒购自Abnova公司。此试剂盒通过测定聚蛋白多糖酶分解聚蛋白多糖底物ARGSVIL片段的浓度来反应聚蛋白多糖酶的酶解活性。应用肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)对纤维连接蛋白(FN)进行瓜氨酸化并采用蛋白印迹法进行验证；应用酶联免疫吸附法比较FN和cFN与2种不同分子量的ADAMTS-4的结合活性；使用聚蛋白多糖酶活性分析试剂盒测定2种ADAMTS-4的活性和其与FN、cFN结合后酶活性的变化。数值结果应用SPSS19.0软件进行统计学分析,两组数据比较采用t检验,多组数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)蛋白印迹法证实兔源PADI4可以使来源于人血浆纤维蛋白原的分子为40000的纤维连接蛋白片段瓜氨酸化为瓜氨酸化的纤维连接蛋白片段。(2)瓜氨酸化后的纤维连接蛋白与相对分子质量为93000的ADAMTS-4的结合活性明显低于未瓜氨酸化的纤维连接蛋白(分别为0.624±0.033,2.182±0.042,t=50.522,P=9.186E-07),而两者与缺失碳端的相对分子质量为53000的ADAMTS-4的结合活性差异无统计学意义(分别为0.934±0.012,0.971±0.024,t=2.388,P=0.075)。(3)相对分子质量为93000的ADAMTS-4能够酶解聚蛋白多糖产生大量酶解产物[ARGxx肽段浓度：(0.908±0.088)nmol/L],与纤维连接蛋白结合后降解聚蛋白多糖的能力明显下降[ARGxx肽段浓度：(0.573±0.000)nmol/Lt=6.594,P=0.003],与瓜氨酸化的纤维连接蛋白孵育后的ADAMTS-4降解聚蛋白多糖产生的ARGxx肽段浓度(0.830±0.020nM)明显高于与未瓜氨酸化的纤维连接蛋白(0.573±0.000nmol/L)孵育后的ADAMTS-4(t=22.257, P=2.413E-05)。(4)相对分子质量为53000的ADAMTS-4的酶活性明显高于相对分子量为90000的ADAMTS-4,而且在与纤维连接蛋白或瓜氨酸化的纤维连接蛋白孵育前后酶活性无明显变化(P值分别为0.092、0.094)。结论(1)在PADI4的参与下,FN可被瓜氨酸化为cFN。(2)FN能够结合相对分子质量为90000的ADAMTS-4,并使它的酶解活性明显下降。cFN与相对分子质量为90000的ADAMTS-4的结合活性明显低于FN,且抑制ADAMTS-4活性的作用也明显减弱。(3)缺失碳端的相对分子质量为53000的ADAMTS-4表现出强烈的水解聚蛋白多糖Glu373-Ala374位点的活性,且在与FN或cFN结合前后酶解活性没有明显变化。