柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）属于小RNA病毒科（Picornaviridae）,肠道病毒属（Enterovirus,EV）,肠道病毒A组,其原型株（G-10）于1951年在南非地区被分离鉴定出来。根据VP1基因构建的系统发生树和核苷酸序列的差异性,可将目前为止全球的CVA16流行株分为3个基因型,分别为A、B和D。B基因型可进一步分为3个基因亚型,分别为B1、B2和B3。2000年以后,B1基因亚型逐渐替代B2基因亚型成为主要流行株,B1基因亚型可进一步分为3个进化分支,分别为B1a、B1b和B1c。CVA16、EV-A71和CVA6是手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）的主要病原体,主要引起5岁以下儿童的感染。CVA16曾引起过多次HFMD的暴发流行,主要在亚太地区流行。然而,与EV-A71相比,CVA16引起的HFMD临床表现一般较轻,其感染多呈自限性,但也有少数危重和死亡病例。EV为RNA病毒,由于病毒的RNA依赖的RNA聚合酶缺乏校对功能,导致其基因在复制过程中能够发生高频率的突变和重组,为病毒的进化提供强大的动力。重要位点的突变和基因重组有可能改变病毒的生物学性状,使病毒的抗原性和致病性发生改变,可导致病毒的免疫逃逸、抵抗抗病毒药物治疗等,造成病毒在人群中的传播能力增强。目的:了解2010年～2019年北京地区HFMD及疑似HFMD患儿中CVA16的分子流行病学和遗传进化特征,掌握地区优势流行株,分析CVA16基因的多样性、进化速率、氨基酸变异及基因重组情况,为临床防控和疫苗研究提供参考依据。方法:结合肠道病毒分型结果及流行病学资料,回顾性分析2010年3月～2019年10月就诊于首都儿科研究所附属儿童医院感染科的临床诊断为手足口病、疱疹性咽峡炎及发热伴出疹患儿中CVA16的流行特征。按照一定比例从各年份中随机选取CVA16阳性标本,通过RT-PCR及一代测序方法获取CVA16的VP1基因序列。使用DNAStar v.5.01软件对测序结果进行序列拼接;使用MEGA v.6.05软件构建系统发生树,了解北京地区CVA16的分子流行病学情况,并通序列比对了解VP1基因核苷酸和氨基酸序列的多样性。通过BEAST v.1.10.4软件构建MCC树,进一步确认北京地区CVA16流行株的基因分型及其分子进化特征,对VP1基因的进化速率、最近共同祖先株和群体流行动力学进行分析。使用Datamonkey对VP1基因的自然选择位点进行分析。为更加全面地了解CVA16的基因进化特征,按照一定比例从各年份中随机选取CVA16毒株,通过RT-PCR及一代测序方法获得其全基因组序列。使用MEGA v.6.05软件根据VP1基因构建系统发生树,了解各毒株的基因分型;分析各基因编码区及非编码区的核苷酸（及氨基酸）序列多样性,并了解衣壳蛋白VP1、VP2及VP3上中和抗原表位的氨基酸变异情况。通过BEAST v.1.10.4软件对各基因编码区的进化速率和最近共同祖先株进行分析,了解各基因片段的分子进化特征。使用Datamonkey分析基因编码区的自然选择压力位点。使用RDP4、Sim Plot v.3.5.1软件分析北京地区CVA16的基因重组情况,并通过构建系统发生树来验证数据分析结果。根据VP1和3D基因构建系统发生树,了解北京地区CVA16的重组形式。结果:1)纳入回顾性分析的咽拭子标本共计4 709份,其中3 180份经病原学检测为EV阳性,814份为CVA16阳性。5岁以下儿童为主要的感染人群,并以1～3岁的儿童的比例最高。2010年～2019年间,CVA16在北京地区的流行出现了明显的波动,并存在周期性的流行模式。2013年,CVA6替代CVA16和EV-A71成为主要病原体。2014年,CVA16和EV-A71再次成为主要病原体,随后被CVA6替代。2018年～2019年,CVA16的流行和有效种群大小均呈上升趋势。共获得172个VP1基因序列,平均进化速率为4.49×10-3碱基替换/位点/年(95%HPD:3.98×10-3～4.98×10-3)。北京地区CVA16的流行株均属于B1基因亚型,其中B1b进化分支为优势流行株,在2010年～2019年间持续流行。2016年,北京地区首次发现1个B1c流行株。自2012年起,CVA16 VP1蛋白的N端出现的固定遗传变异L23M,可能与B1b的持续流行相关。北京地区CVA16流行株的VP1基因处于较强的净化选择压力中,但是存在2个偶发的正向选择位点,其中一个位点位于中和抗原表位上。2)获得CVA16全基因组序列共81个。各毒株均属于B1基因亚型,其中包括B1a进化分支8株,B1b进化分支73株。P1区核苷酸及氨基酸序列一致性高于P2和P3。P1区中,VP1、VP2和VP3的核苷酸及氨基酸序列一致性高于VP4。CVA16毒株的各基因片段具有不同的进化速率,但最近共同祖先株出现时间相近。不同基因片段的核苷酸序列差异性可具有不同的变化趋势,VP1基因的变化趋势与全基因组的基本一致。衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的中和抗原表位存在散发的氨基酸变异。CVA16的多数编码基因处于净化选择压力中,然而大量CVA16毒株在2A和3D基因的正向选择位点存在氨基酸变异,以上变异可能与病毒的流行相关。本研究通过生物信息学分析发现2个基因重组毒株,一个为CVA16的亚型内重组株,另一个为CVA16与CVA2的种内重组株,重组断点分别位于3B基因和5’UTR区。北京地区CVA16毒株的重组形式包括RF-B和RF-D,并以RF-D为主。结论:2010年～2019年,北京地区CVA16流行株属于B1基因亚型,B1b进化分支为优势流行株。CVA16基因组遗传变异较为活跃,突变为病毒基因的重要进化方式。2018年～2019年,北京地区HFMD及疑似HFMD患儿中CVA16的群体感染水平持续增高,可能与病毒重要位点的氨基酸变异及种内基因重组相关。应继续关注CVA16的分子流行病学及其基因进化特征。