论文部分内容阅读
目的:
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的发生的主要原因，并且30％～40％的1型糖尿病患者和15％～20％的2型糖尿病患者并发糖尿病肾病。目前西医对DN的发病机制认识尚不完全清楚，还不能针对病因治疗，主要以控制血糖、血脂、血压，减少蛋白尿等方面进行对症处理，缺乏理想的治疗药物，进一步研究DN的发病机制，寻找有效的治疗药物，是目前国内外研究的重点和热点之一。已有的研究表明肾脏纤维化是DN的主要病理特征，糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)诱导的肾脏氧化应激的增加是糖尿病肾脏纤维化的主要发病机制，smad3/miRNAs通路参与DN氧化应激和肾脏纤维化的调控过程，是治疗DN的潜在作用靶点。中医药治疗DN历史悠久，留下不少效疗确切的方药，对这些方药进行研究，优化处方，探明其作用机制，将为治疗DN的创新中药打下基础，具有重要意义。益气活血固肾颗粒(Yiqi Huoxue Gushen Granules，YHGG)是导师全世建教授在临床经验基础上对经方大黄黄连泻心汤处方优化而创制而成，由黄芪、黄连、大黄、水蛭、益智仁、牛大力等六味中药组成。前期该方临床用于治疗早期糖尿病肾病取得了较好疗效，但其具体作用机制还不清楚。本课题拟开展该方对db/db糖尿病肾病小鼠模型经smad3/miRNAs介导的氧化应激通路的影响，进一步阐明其改善糖尿病肾病的作用机制，为创制治疗糖尿病肾病的新药打下基础，具有重要的意义。
方法:
1、益气活血固肾颗粒质量标准的建立
采用HPLC-ESI-MS检测益气活血固肾颗粒中的成分，并对其中丰度较高的成分进行分析，确定其主要成分;通过HPLC法分别测定3批益气活血固肾颗粒中9种指标性成分次黄嘌呤、没食子酸、阿魏酸、药根碱、盐酸小檗碱、巴马汀、芒柄花素、白杨素、大黄素的含量;并对方法学的精密度、稳定性、重复性和加样回收率进行考察，确定该颗粒有效成分的检测方法。
2、益气活血固肾颗粒对糖尿病肾病小鼠保护作用机制的研究
选用db/db糖尿病肾病小鼠模型，给予益气活血固肾颗粒高、中、低剂量，盐酸二甲双胍作为对照组，连续灌胃8周后，收集小鼠24h尿液、血清、肾脏组织等。观察益气活血固肾颗粒对db/db模型小鼠饮食、尿量、体重的影响，对血糖、血脂、血清胰岛素、肾功能、肾组织病理变化的影响及对miRNAs表达的影响。采用电镜、免疫荧光、RT-PCR等方法检测模型糖脂代谢药效指标和miRNAs表达相关指标:包括血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮（BUN）、尿肌酐(Ucr)、胰岛素(FINS)，小鼠肾脏丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH-Px)、肾脏组织病理学改变及肾脏COLI、COLIII、α-SMA蛋白表达情况和COLlal、COL3al、a-SMA、smad3、miRNA21、miRNA29a、miRNA29b-1和miRNA29c mRNA表达水平。阐明益气活血固肾颗粒通过调控smad3/miRNAs治疗糖尿病肾病分子机制。
结果:
1、建立了益气活血固肾颗粒质量控制:检测并分析了30多种成分，并对其中9个指标性成分进行了含量确定。采用HPLC-MS法测定次黄嘌呤、没食子酸、阿魏酸、药根碱、盐酸小檗碱、巴马汀、芒柄花素、白杨素、大黄素9种指标性成分，平均含量为0.157mg/g、16.261mg/g、0.187mg/g、0.765mg/g、35.712mg/g、2.043mg/g、0.379mg/g、0.312mg/g、0.114mg/g;在各自浓度范围内线性关系良好（r≥0.9990）;平均加样回收率为89.52％～105.65％，RSD为2.31％～4.13％。
2、初步阐明了益气活血固肾颗粒治疗糖尿病肾病的分子机制:与db/db模型组比较，益气活血固肾颗粒可以显著改善模型小鼠一般状况;显著降低模型小鼠血糖、FrNS水平，提高胰岛素敏感指数和降低胰岛素抵抗指数;显著降低模型小鼠TG、TC、24h尿蛋白、Ucr、BUN和Scr水平，改善模型小鼠的血脂和肾功能:显著改善模型小鼠肾脏组织中SOD、MDA和GSH-Px等氧化应激指标，具有抗氧化性损伤的作用;显著改善模型小鼠的肾脏病理变化;显著降低模型小鼠肾脏组织中COLI、COLIII、α-SMA的蛋白表达;显著降低模型小鼠肾脏组织中COL1a1、COL3a1、smad3和miRNA21的表达，增加miRNA29s的表达。
结论:
益气活血固肾颗粒成分稳定，采用HPLC-ESI-MS方法检测益气活血固肾颗粒的成分，对其中9种指标性成分进行含量测定，简单、快速、灵敏度高，方法可行，为益气活血固肾颗粒质量标准的建立打下了基础;益气活血固肾颗粒治疗糖尿病肾病有较好疗效，具有较好改善db/db糖尿病肾病模型小鼠的糖脂代谢和肾功能作用，其作用机制可能是通过调节smad3/miRNAs介导的氧化应激反应，缓解db/db小鼠肾间质纤维化，从而起到保护肾脏的作用。
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的发生的主要原因，并且30％～40％的1型糖尿病患者和15％～20％的2型糖尿病患者并发糖尿病肾病。目前西医对DN的发病机制认识尚不完全清楚，还不能针对病因治疗，主要以控制血糖、血脂、血压，减少蛋白尿等方面进行对症处理，缺乏理想的治疗药物，进一步研究DN的发病机制，寻找有效的治疗药物，是目前国内外研究的重点和热点之一。已有的研究表明肾脏纤维化是DN的主要病理特征，糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)诱导的肾脏氧化应激的增加是糖尿病肾脏纤维化的主要发病机制，smad3/miRNAs通路参与DN氧化应激和肾脏纤维化的调控过程，是治疗DN的潜在作用靶点。中医药治疗DN历史悠久，留下不少效疗确切的方药，对这些方药进行研究，优化处方，探明其作用机制，将为治疗DN的创新中药打下基础，具有重要意义。益气活血固肾颗粒(Yiqi Huoxue Gushen Granules，YHGG)是导师全世建教授在临床经验基础上对经方大黄黄连泻心汤处方优化而创制而成，由黄芪、黄连、大黄、水蛭、益智仁、牛大力等六味中药组成。前期该方临床用于治疗早期糖尿病肾病取得了较好疗效，但其具体作用机制还不清楚。本课题拟开展该方对db/db糖尿病肾病小鼠模型经smad3/miRNAs介导的氧化应激通路的影响，进一步阐明其改善糖尿病肾病的作用机制，为创制治疗糖尿病肾病的新药打下基础，具有重要的意义。
方法:
1、益气活血固肾颗粒质量标准的建立
采用HPLC-ESI-MS检测益气活血固肾颗粒中的成分，并对其中丰度较高的成分进行分析，确定其主要成分;通过HPLC法分别测定3批益气活血固肾颗粒中9种指标性成分次黄嘌呤、没食子酸、阿魏酸、药根碱、盐酸小檗碱、巴马汀、芒柄花素、白杨素、大黄素的含量;并对方法学的精密度、稳定性、重复性和加样回收率进行考察，确定该颗粒有效成分的检测方法。
2、益气活血固肾颗粒对糖尿病肾病小鼠保护作用机制的研究
选用db/db糖尿病肾病小鼠模型，给予益气活血固肾颗粒高、中、低剂量，盐酸二甲双胍作为对照组，连续灌胃8周后，收集小鼠24h尿液、血清、肾脏组织等。观察益气活血固肾颗粒对db/db模型小鼠饮食、尿量、体重的影响，对血糖、血脂、血清胰岛素、肾功能、肾组织病理变化的影响及对miRNAs表达的影响。采用电镜、免疫荧光、RT-PCR等方法检测模型糖脂代谢药效指标和miRNAs表达相关指标:包括血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮（BUN）、尿肌酐(Ucr)、胰岛素(FINS)，小鼠肾脏丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH-Px)、肾脏组织病理学改变及肾脏COLI、COLIII、α-SMA蛋白表达情况和COLlal、COL3al、a-SMA、smad3、miRNA21、miRNA29a、miRNA29b-1和miRNA29c mRNA表达水平。阐明益气活血固肾颗粒通过调控smad3/miRNAs治疗糖尿病肾病分子机制。
结果:
1、建立了益气活血固肾颗粒质量控制:检测并分析了30多种成分，并对其中9个指标性成分进行了含量确定。采用HPLC-MS法测定次黄嘌呤、没食子酸、阿魏酸、药根碱、盐酸小檗碱、巴马汀、芒柄花素、白杨素、大黄素9种指标性成分，平均含量为0.157mg/g、16.261mg/g、0.187mg/g、0.765mg/g、35.712mg/g、2.043mg/g、0.379mg/g、0.312mg/g、0.114mg/g;在各自浓度范围内线性关系良好（r≥0.9990）;平均加样回收率为89.52％～105.65％，RSD为2.31％～4.13％。
2、初步阐明了益气活血固肾颗粒治疗糖尿病肾病的分子机制:与db/db模型组比较，益气活血固肾颗粒可以显著改善模型小鼠一般状况;显著降低模型小鼠血糖、FrNS水平，提高胰岛素敏感指数和降低胰岛素抵抗指数;显著降低模型小鼠TG、TC、24h尿蛋白、Ucr、BUN和Scr水平，改善模型小鼠的血脂和肾功能:显著改善模型小鼠肾脏组织中SOD、MDA和GSH-Px等氧化应激指标，具有抗氧化性损伤的作用;显著改善模型小鼠的肾脏病理变化;显著降低模型小鼠肾脏组织中COLI、COLIII、α-SMA的蛋白表达;显著降低模型小鼠肾脏组织中COL1a1、COL3a1、smad3和miRNA21的表达，增加miRNA29s的表达。
结论:
益气活血固肾颗粒成分稳定，采用HPLC-ESI-MS方法检测益气活血固肾颗粒的成分，对其中9种指标性成分进行含量测定，简单、快速、灵敏度高，方法可行，为益气活血固肾颗粒质量标准的建立打下了基础;益气活血固肾颗粒治疗糖尿病肾病有较好疗效，具有较好改善db/db糖尿病肾病模型小鼠的糖脂代谢和肾功能作用，其作用机制可能是通过调节smad3/miRNAs介导的氧化应激反应，缓解db/db小鼠肾间质纤维化，从而起到保护肾脏的作用。