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布拉酵母在临床上主要用于防治大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、难辨梭菌、幽门螺杆菌、白假丝酵母和原虫等病原体感染引起的疾病。同时,布拉酵母分泌的碱性磷酸酶(AP)能够对革兰氏阴性菌LPS去磷酸化,而阻断由LPS介导的下游信号通路。本研究一方面研究布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机理。另一方面克隆布拉酵母碱性磷酸酶(SBAP)基因,并实现其在毕赤酵母中重组分泌表达,初步研究rAP对LPS去磷酸化作用,为该蛋白药物治疗LPS所致的疾病提供基础。1)为了探讨布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机理,构建经布拉酵母预处理的小鼠肠炎沙门氏菌感染模型。在感染后监测小鼠体重变化及肠炎沙门氏菌在肝脏和盲肠中的数量,扫描电镜观察布拉酵母对肠道微生物的吸附作用,HE染色观察小鼠肝组织损伤情况。结果表明,感染后第11天,布拉酵母缓解由肠炎沙门氏菌感染所致的小鼠体重下降的现象(25.9g：22.3g)(p<0.05)。在盲肠定植的肠炎沙门氏菌数由107cfu/g降低为105cfu/g,其在肝脏的数量由104cfu/g降低为4×102cfu/g。肝组织HE染色结果表明,布拉酵母能够缓解由肠炎沙门氏菌感染所引起的中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润肝细胞所造成的肝损伤。2)本试验通过酵母属AP蛋白序列相似性比对,据得到保守位点设计兼并引物,克隆SBAP基因。构建毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPICSAP,电转毕赤酵母X-33,将筛选后表达重组AP(rAP)的重组酵母在200ml摇瓶水平放大诱导表达,其发酵液上清用HisTrapHP柱纯化。结果表明,成功克隆SBAP基因,其大小为1701bp,无内含子,包含一个终止密码子,GenBank编号为KF471017。 pPICSAP重组表达菌株在200ml摇瓶水平诱导表达120h时,rAP的浓度达到最大值为43.66mg/1.纯化过程中确定洗脱缓冲液中咪唑最适浓度为250mM,洗脱峰经SDS-PAGE凝胶电泳和Bandscale软件分析,呈单一条带,其纯度达到90%以上。3)本试验初步测定在二乙醇胺缓冲液中,Mg2+、EDTA、温度和pH对rAP酶活性的影响,及在最佳酶活条件下测定rAP的比活。同时,在pH2-10的Tris-HCl缓冲液中,体外检测rAP对LPS去磷酸化功效,及腹腔注射经rAP去磷酸化后的LPS对小鼠血清中TNF-α表达水平的影响。结果表明,在二乙醇胺缓冲液中,rAP的最佳反应条件是pH9.6,2mM Mg2+,温度为60℃,且EDTA为rAP的强抑制剂,1mM的EDTA将rAP的酶活抑制到其活性的18.37%。rAP比活为9912U/mg,是先前研究中重组表达的小牛肠AP比活的3倍。rAP温度稳定性分析显示其在37℃处理1h后,其酶活性仍维持在80%以上,但随着温度提高,酶活性逐渐降低,在100℃处理1h后,酶活性基本丧失。此外,在pH2-10的Tris-HCl缓冲液中,rAP对LPS均具有去磷酸化活性。经rAP去磷酸化后的LPS与野生型的LPS相比,显著减少了小鼠血清中TNF-α表达水平(55.16ng/1比64.24ng/1),(p<0.01)。综上,布拉酵母能缓解肠炎沙门氏菌感染小鼠肝脏诱导的肝损伤。同时,本研究首次报道并克隆SBAP基因,实现其在毕赤酵母中高活性分泌表达,建立rAP的Ni亲和层析柱一步纯化法,且rAP对LPS具有解毒功能。本研究获得的rAP将为治疗LPS所致的疾病提供有效的候选生物材料。