目的:呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)是一种有包膜的、单负链RNA病毒,属副粘病毒科。RSV可引起严重的急性下呼吸道感染,是导致小儿病毒性肺炎最常见的病原体之一。三结构域(Tripartite motif,TRIM)蛋白家族隶属于E3泛素连接酶家族,家族中多数成员的氨基末端具有典型的RBCC结构域。辅以羧基末端PRY、SPRY、ARF等特殊结构域,使TRIM蛋白家族在生物学功能上具有多样性。TRIM蛋白家族在细胞凋亡、自噬、癌症发生中均扮演重要的角色,近年来,越来越多的研究显示:TRIM蛋白家族还在固有免疫,尤其是抗病毒固有免疫应答调控中发挥重要作用。许多TRIM蛋白通过诱导Ⅰ型干扰素,发挥抗病毒作用。然而,并非所有的TRIM家族成员与入侵宿主的病毒“不共戴天”,极少数TRIM家族成员如TRIM6、TRIM23、TRIM29等可以负向调控抗病毒免疫应答而发挥促病毒复制的作用。TRIM蛋白在RSV病毒感染中发挥何种作用,尚不清楚。课题组前期通过基因表达谱芯片技术,获得了感染RSV的A549细胞的基因表达谱数据,筛选到五种可能与RSV感染密切相关的TRIM蛋白,包括TRIM21,TRIM22,TRIM14,TRIM25和TRIM38。本研究主要锁定TRIM21蛋白,欲探讨其在RSV感染中的作用,这将有助于人们深入理解宿主和病毒的相互作用,为阐明RSV致病机制,开发新的靶向TRIM家族蛋白的药物奠定基础。方法:1明确RSV感染对A549细胞TRIM21蛋白表达的影响。1.1 GFP-RSV以不同感染复数(MOI)感染A549细胞,通过荧光显微镜观察GFP-RSV融合病毒其标签蛋白GFP在A549细胞中的表达;qPCR检测不同MOI RSV感染对TRIM21 mRNA表达的影响,以确定RSV感染的最佳MOI。1.2以最佳MOI的RSV感染A549细胞,在不同时间点,采用qPCR和Western blot方法分别检测TRIM21 mRNA和蛋白表达水平的变化,明确RSV感染对A549细胞TRIM21蛋白表达的影响,并为后续试验确定检测的最佳时间点。2构建pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒和pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒。3应用多种手段明确TRIM21的亚细胞定位。3.1 RSV感染A549细胞48h后,分离核蛋白和浆蛋白,用Western blot检测TRIM21蛋白在细胞核和细胞浆蛋白中的表达,明确TRIM21蛋白在细胞中的定位。3.2将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染爬片生长的A549细胞24h后,再感染RSV 24h,TRIM21蛋白经免疫荧光染色后,于正置荧光显微镜下观察其表达定位。4明确TRIM21对RSV病毒复制的影响。4.1应用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,再感染RSV,于感染后0h、24h、48h收集细胞,提取细胞总RNA和蛋白,应用qPCR和Western blot方法验证TRIM21的敲低效果。4.2应用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,再感染RSV,于感染后24h和48h,采用qPCR和病毒滴定的方法分别检测RSV N基因mRNA表达水平及病毒滴度的变化,探讨敲降TRIM21对RSV病毒复制的影响。4.3用pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒,转染A549细胞,应用qPCR和Western blot方法分别检测TRIM21 mRNA和蛋白表达水平,验证其过表达效果。4.4将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,再感染RSV,采用qPCR和病毒滴定的方法分别检测RSV N基因mRNA表达水平以及病毒滴度的变化,探讨过表达TRIM21对RSV病毒复制的影响。5明确TRIM21蛋白对RSV诱导的Ⅰ型干扰素的影响。5.1应用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,再感染RSV 24h,qPCR检测Ⅰ型干扰素及下游一系列干扰素刺激基因(ISGs)的mRNA表达变化,探讨敲降TRIM21对RSV诱导的Ⅰ型干扰素及ISGs基因表达的影响。5.2将siTRIM21、pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶参照质粒pGL4.10-TK共转染A549细胞24h后,应用双荧光素酶报告实验检测干扰素β启动子活性,明确敲降TRIM21对IFNβ基因启动子活性的影响。5.3将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,再感染RSV 24h,qPCR检测Ⅰ型干扰素及下游一系列ISGs基因的mRNA水平,探讨过表达TRIM21对RSV诱导的Ⅰ型干扰素及ISGs基因表达的影响。5.4将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒、pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶参照质粒pGL4.10-TK共转染A549细胞24h后,应用双荧光素酶报告实验检测干扰素β启动子活性,明确过表达TRIM21对IFNβ基因启动子活性的影响。6明确TRIM21和Ⅰ型干扰素之间的相互调控作用。6.1用不同浓度梯度的人源IFNβ重组蛋白刺激A549细胞12h,qPCR检测TRIM21基因的表达情况;以最优剂量的人源IFNβ重组蛋白刺激A549细胞,于不同时间点收集细胞,提取总RNA,qPCR检测TRIM21基因表达水平。明确Ⅰ型干扰素是否可以诱导TRIM21蛋白的表达,即明确TRIM21是否作为一种ISGs基因受Ⅰ型干扰素调控。6.2将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,qPCR检测IFNβ基因的表达水平,明确过表达TRIM21对IFNβ基因表达的影响;将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒、pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶参照质粒pGL4.10-TK共转染A549细胞24h后,应用双荧光素酶报告实验检测干扰素β启动子活性,明确过表达TRIM21对IFNβ基因启动子活性的影响。结合两个实验结果,明确TRIM21是否参与调控细胞的Ⅰ型干扰素通路。7明确TRIM21可通过干扰素非依赖机制促进RSV病毒复制。应用干扰素基因自然缺失的Vero细胞,探讨TRIM21是否通过干扰素依赖机制促进RSV病毒复制。7.1应用siRNA敲低Vero细胞TRIM21基因的表达后,再感染RSV,采用Western blot和病毒滴定的方法分别检测RSV病毒蛋白表达及病毒滴度的变化,探讨敲降TRIM21对Vero细胞中RSV病毒复制的影响。7.2将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染Vero细胞24h后,再感染RSV,采用Western blot和病毒滴定的方法分别检测RSV病毒蛋白表达及病毒滴度的变化,探讨过表达TRIM21对Vero细胞中RSV病毒复制的影响。8明确TRIM21可通过自噬机制促进RSV病毒复制。8.1以最佳MOI的RSV感染A549细胞后,在不同时间点收集细胞并提取细胞总蛋白,采用Western blot方法检测LC3Ⅱ蛋白的表达,验证RSV感染是否可诱导A549细胞的自噬。8.2应用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,再感染RSV,采用Western blot方法检测A549细胞LC3Ⅱ蛋白的表达,探讨敲降TRIM21对自噬水平的影响。8.3将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,再感染RSV,采用Western blot方法检测A549细胞LC3Ⅱ蛋白的表达,探讨过表达TRIM21对自噬水平的影响。8.4应用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,用自噬诱导剂(雷帕霉素Rapamycin,100nM)处理A549细胞以回复自噬水平,再感染RSV。感染后24h通过倒置荧光显微镜观察GFP-RSV病毒荧光;用qPCR检测RSV N、RSV F、RSV NS1基因mRNA表达水平。以验证自噬诱导剂是否可以回复因敲低TRIM21而引起的病毒复制减少。8.5将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,用自噬抑制剂(渥曼青霉素Wortmannin,100nM)处理A549细胞以抑制自噬水平,再感染RSV。感染后24h通过倒置荧光显微镜观察GFP-RSV病毒荧光;用qPCR检测RSV N、RSV F、RSV NS1基因mRNA表达水平。以验证自噬抑制剂是否可以回复因过表达TRIM21而引起的病毒复制增加。结果:1 RSV感染对A549细胞TRIM21蛋白表达的影响。1.1用倒置荧光显微镜初步观察GFP-RSV融合病毒其标签蛋白GFP在A549细胞中的表达。感染RSV 24h后,随着感染复数的增加,镜下荧光斑点数量和亮度有明显增加。qPCR结果显示,当MOI=1时,RSV对TRIM21的诱导作用最强,则将其确定为最佳感染复数。1.2.RSV(MOI=1)感染A549细胞,在感染后0h、6h、12h、24h、36h、48h,qPCR结果显示:感染后12h,TRIM21 mRNA的表达开始有明显上调,持续升高,直至检测时间点48h;Western Blot结果表明,感染后12h,TRIM21蛋白的表达开始有明显上调,持续升高,直至检测时间点48h。即:RSV感染可诱导TRIM21蛋白高表达,呈明显的时间依赖关系。2成功构建pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒和pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒2.1成功构建pCAGGS-HA-TRIM21载体,经酶切和测序鉴定正确。2.2成功构建pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告基因载体,经酶切和测序鉴定正确。3利用多种手段确定TRIM21的亚细胞定位3.1 RSV感染A549细胞48h后,分离核蛋白和浆蛋白,Western blot检测结果显示,TRIM21蛋白大多数表达在细胞浆之中。3.2用pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染爬片生长的A549细胞24h后,再感染RSV 24h,免疫荧光染色,荧光显微镜观察结果显示,TRIM21蛋白几乎全部分布于细胞浆之中,呈片状散在分布。4 TRIM21蛋白对RSV病毒复制的影响4.1将TRIM21的siRNA转染A549细胞24h后,再感染RSV,在感染后0h,24h,48h收集细胞,分别进行qPCR和Western Blot检测。结果显示,与对照组相比,敲低TRIM21后,TRIM21 mRNA及蛋白表达均显著下降,提示敲低效果较好。4.2将siTRIM21转染A549细胞24h后,再感染RSV,于感染后24h和48h,收集细胞,进行qPCR和病毒滴度检测。qPCR结果显示,与对照组相比,敲低TRIM21后,RSV N基因mRNA表达有明显下降;病毒滴定(感染后24h)结果显示,与对照组相比,敲低TRIM21可明显降低RSV病毒滴度。4.3将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞,收集细胞,分别进行qPCR和Western blot检测。结果显示,与pCAGGS-HA空载转染组相比,pCAGGS-HA-TRIM21转染组中TRIM21mRNA及蛋白的表达均有显著升高,提示过表达效果较好。4.4将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,再感染RSV 24h,收集细胞,进行qPCR和病毒滴定检测。qPCR结果显示,与对照组相比,过表达TRIM21可明显提高RSV N基因mRNA的表达;病毒滴定结果显示:过表达TRIM21可明显提高病毒滴度。5 TRIM21蛋白对RSV诱导的Ⅰ型干扰素的影响5.1用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,再感染RSV,感染后24h,收集细胞,进行qPCR,结果显示,敲降TRIM21可明显降低Ⅰ型干扰素及其下游一系列干扰素刺激基因(ISGs)的mRNA的表达。5.2将siTRIM21、pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶参照质粒pGL4.10-TK共转染A549细胞24h后,再感染RSV,感染后24h,进行双荧光素酶报告实验。结果显示,敲降TRIM21可明显降低干扰素β启动子活性。5.3将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,再感染RSV 24h,收集细胞,进行qPCR检测。结果显示,过表达TRIM21可明显上调Ⅰ型干扰素及下游一系列ISGs基因的mRNA的表达。5.4将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒、pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶参照质粒pGL4.10-TK共转染A549细胞24h后,再感染RSV 24h,进行双荧光素酶报告实验。检测结果显示,过表达TRIM21可明显增加干扰素β启动子活性。6 TRIM21与Ⅰ型干扰素的相互诱导作用6.1用不同浓度梯度的人源IFNβ重组蛋白刺激A549细胞12h,qPCR结果显示,以5ng/ml极低浓度的人源IFNβ重组蛋白就足以诱导TRIM21基因的高表达,不同剂量对TRIM21的诱导作用差别不大。确定最优剂量后,以该剂量的人源IFNβ重组蛋白刺激A549细胞,分别于0h,4h,8h,12h和16h收集细胞,进行qPCR检测。结果显示,人源IFNβ重组蛋白刺激A549细胞后4h,即可明显提高TRIM21的表达水平,于12h达到峰值。6.2将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,收集细胞,进行qPCR检测。结果显示:过表达TRIM21可明显提高IFNβ基因mRNA的表达水平;将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒、pGL4.10-IFNβpromoter荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶参照质粒pGL4.10-TK共转染A549细胞24h后,进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,过表达TRIM21可明显提高干扰素β启动子活性。综合两个实验结果,提示:TRIM21参与调控A549细胞的Ⅰ型干扰素通路。7 TRIM21可通过干扰素非依赖机制促进病毒复制7.1应用siRNA敲低干扰素基因自然缺失的Vero细胞的TRIM21基因表达之后,再感染RSV 24h,进行Western blot和病毒滴定。Western blot结果显示:敲低TRIM21明显降低RSV病毒蛋白表达;病毒滴定(感染后24h)结果显示:敲低TRIM21可明显降低RSV病毒滴度。7.2用pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染Vero细胞24h后,再感染RSV 24h,收集细胞,进行Western blot和病毒滴定。Western blot结果显示:过表达TRIM21可明显升高RSV病毒蛋白表达;病毒滴定(感染后24h)结果显示:过表达TRIM21可明显提高RSV病毒滴度。8 TRIM21可通过自噬机制促进RSV病毒复制。8.1以最佳MOI的RSV感染A549细胞后,于0h、24h、48h收集细胞,提取细胞总蛋白,进行Western blot。Western blot结果显示,RSV感染细胞后,LC3Ⅱ蛋白表达增高,即RSV成功诱导了A549细胞的自噬,一直持续到检测点48h。8.2应用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,再感染RSV,于感染后24h,进行Western blot。结果显示,无论是否有RSV感染,敲低TRIM21后均能降低LC3Ⅱ蛋白表达,提示敲低TRIM21表达可以降低细胞自噬水平。8.3将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,再感染RSV,于感染后24h,进行Western blot。结果显示,无论是否有RSV感染,过表达TRIM21后均能提高LC3Ⅱ蛋白表达,提示过表达TRIM21可以提高细胞自噬水平。8.4应用siRNA敲低A549细胞TRIM21基因的表达后,用自噬诱导剂处理A549细胞以回复自噬水平,再感染RSV。感染后24h用倒置荧光显微镜初步观察,敲低TRIM21之后,与对照组相比,GFP-RSV病毒荧光斑点数量明显减少,与之前结果一致。在敲低TRIM21的基础上,再加入自噬诱导剂,GFP-RSV病毒荧光斑点数量明显增加;qPCR结果显示,自噬诱导剂不会影响TRIM21基因的表达,但与单独敲低TRIM21组比较,自噬诱导剂可以明显回复RSV N、RSV F、RSV NS1基因的表达水平。提示:自噬诱导剂可以回复因敲低TRIM21引起的病毒复制减少。8.5将pCAGGS-HA-TRIM21真核表达质粒转染A549细胞24h后,用自噬抑制剂处理A549细胞以抑制自噬水平,再感染RSV。感染后24h用倒置荧光显微镜初步观察,过表达TRIM21之后,与对照组相比,GFP-RSV病毒荧光斑点数量明显增加,与之前结果一致。在过表达TRIM21的基础上,再加入自噬抑制剂,GFP-RSV病毒荧光斑点数量明显减少;qPCR结果显示,自噬抑制剂不会影响TRIM21基因的表达,但与单独过表达TRIM21组比较,自噬抑制剂可以明显抑制RSV N、RSV F、RSV NS1基因的表达水平。提示:自噬抑制剂可以抑制因过表达TRIM21引起的病毒复制增加。结论:1.RSV感染可以上调A549细胞中TRIM21 mRNA及蛋白的表达。2.TRIM21蛋白主要定位于细胞浆中。3.TRIM21蛋白可以促进RSV复制。4.TRIM21与Ⅰ型干扰素可以相互诱导,并很可能存在一个正反馈环路。5.TRIM21蛋白可通过干扰素非依赖机制促进RSV复制。6.TRIM21蛋白可通过自噬机制促进RSV复制。