利用染色体片段导入系挖掘水稻粒型基因

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hutao95
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水稻粒型作为重要农艺性状之一,不仅影响其外观品质,而且对单株产量具有一定的影响。本研究以两套高世代回交导入系群体为基础材料,构建和完善染色体片段导入系(Chromosome segment substitution line,CSSL)。利用新构建的导入系群体进行粒型的遗传基础分析,检测到75个粒型数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL),并对其中2个新的粒长QTL进行了精细定位与基因克隆,主要结果如下:1.利用原有的Nipponbare(NIP)/ZS97(NZ)和ACC10/ZS97(AZ)导入系构建了两套新的导入系群体,分别命名为DNZ和DAZ群体。它们分别包含221和147份导入系。利用8K SNP芯片对导入系群体的基因型分析结果显示,DNZ和DAZ群体分别包含142(64%)和72(49%)份单片段导入系。基于两套群体中导入片段的重组断点信息,分别构建包含418和325个bin(最小的重组区段)的遗传图谱,DNZ和DAZ群体中bin大小的中位数分别为470 kb和764 kb。2.考察DNZ和DAZ群体的粒型表型,分别结合各自的群体bin图谱,采用岭回归方法进行QTL分析。在DNZ群体中检测到的粒型QTL有50个,其中粒长QTL16个,粒宽QTL 19个,千粒重QTL 15个;在DAZ群体中检测到的粒型QTL有25,其中粒长QTL 9个,粒宽QTL 12个,千粒重QTL 4个。这些QTL包含的QTL簇(同时影响2-3个粒型性状)有11个,其中有3个QTL在两个群体中同能重复检测到。3.利用分离群体将DNZ群体中检测到的一个新的粒长QTL(q GL11-2)精细定位在25 kb的区间。生物信息学分析表明,Os11g0528700(Os GH3.13)极可能是q GL11-2的候选基因。利用CRISPR/Cas9技术分别对ZH11和9311的Os GH3.13进行敲除试验,发现敲除Os GH3.13后粒长变长、千粒重增加,表明Os GH3.13是q GL11-2的候选基因。比较q GL11-2NIP在ZS97和9311背景两种遗传背景下的效应,发现q GL11-2NIP都能使ZS97和9311增加粒长与千粒重,而不改变粒宽,表明q GL11-2NIP在9311和ZS97两种遗传背景下均具有增加粒长和千粒重的遗传效应。q GL11-2近等基因系的颖壳组织进行细胞学观察,表明q GL11-2主要通过影响颖壳纵向细胞大小来调控粒型。4.利用分离群体将DAZ群体中检测到的一个新的主效粒长QTL q GL6-2精细定位在11 kb的区间内,该区间包含一个注释基因LOC_Os06g44620(Os4CL4)。Os4CL4编码一个4-香豆酸辅酶A连接酶。双亲序列比对分析显示,Os4CL4编码区存在2个非同义SNP,而启动子区变异较大,其中Os4CL4ZS97启动子区ATG上游543 bp处插入13 kb转座子,而Os4CL4ACC10没有插入。基因表达分析结果表明,在穗发育过程中Os4CL4ACC10的表达要显著高于Os4CL4ZS97。利用重亚硫酸氢盐测序启动子区发现,在Os4CL4ZS97启动子区13 kb插入附近甲基化程度显著高于Os4CL4ACC10,表明13 kb插入可使该区域甲基化程度升高,导致基因表达下降。启动子活性分析结果支持启动子区转座子的插入是导致基因表达下降的关键因素。5.Os4CL4ACC10基因互补ZS97的转基因试验表明,Os4CL4就是q GL6-2。构建源于ACC10的启动子ProOs4CL4-ACC10接Os4CL4ZS97的载体,并转化ZS97,同样发现,相对于阴性单株,转基因阳性单株的粒长与千粒重显著增加,粒宽不变,表明基因启动子的变异是引起NIL-q GL6-2ACC10与NIL-q GL6-2ZS97粒型差异的主要原因。6.颖壳组织细胞学观察表明,影响q GL6-2近等基因系之间的种子颖壳纵向细胞乳突距离存在显著差异,说明q GL6-2可能通过影响细胞大小调控粒型变化。7.利用原核表达载体分别表达Os4CL4ACC10与Os4CL4ZS97蛋白进行体外酶活实验,结果表明Os4CL4ACC10与Os4CL4ZS97的氨基酸变异不会引起它们的酶活性差异。然而,在q GL6-2近等基因系16 cm穗部组织中香豆酸和咖啡酸的含量存在显著差异。综上表明,Os4CL4的表达差异可能是引起苯丙烷代谢途径中香豆酸和咖啡酸的含量差异的原因。
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