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益生菌在胃肠道中的定殖是发挥其益生作用的前提条件,黏附是益生菌定殖过程的第一步,同时黏附的益生菌能够排斥外来病原菌的入侵,从而起到抑制致病菌感染的作用。由于菌体表面各种与黏附相关的成分是介导黏附的基础,因此,对这些成分的研究是阐明益生菌黏附机理的必要条件。黏附机理的研究对于消化道微生态环境的改善以及病原菌的生态防治均具有重要意义。本文以干酪乳杆菌 LC2W(Lactobacillus casei LC2W)为对象,就其黏附性质、对幽门螺杆菌SSl(Helicobacter pylori SSl)体外黏附抑制作用及其参与黏附过程的表面蛋白成分进行了初步的分离和鉴定。
首先,采用形态学观察和显微计数的方法比较了L.casei LC2W的菌液浓度、悬浮介质及其pH值对人胃癌细胞株MKN-45和HGC-27的黏附情况。结果表明,L.caseiLC2W对两种细胞均具有黏附性,但对MKN-45的黏附性更强。这种黏附作用具有菌浓度依赖性,当加入的菌悬液浓度达到一定数量时(10<9> CFU/mL),平均每个细胞黏附的L.casei LC2W数量趋于饱和。不同的悬浮介质对L.casei LC2W的黏附性也具有显著的差异,其中悬浮于耗尽培养上清液(SCS)的L.casei LC2W表现出最强的黏附性。此外,悬浮介质的pH值对L.casei LC2W的黏附性也有影响,pH值4.0时黏附性最好。将不同悬浮介质的pH值调整到7.0后,SCS仍能很好的促进L.caseiLC2W的黏附作用,表明SCS中存在某种促进黏附的物质。由此推测,L.casei LC2W对胃癌细胞的黏附机理可能为黏附素与受体的特异性结合。
其次,为研究L.casei LC2W和H.pylori SSl对MKN-45细胞的黏附情况,引入数学模型,分别研究了L.casei LC2W与H.pylori SSl的竞争、排除和替代作用。结果表明,L.casei LC2W可以竞争H.pylori SSl黏附位点或受体,使后者的黏附值达不到理论值;L.casei LC2W对H.pylori SSl的黏附具有很强的排除作用而替代作用不明显或过程非常缓慢。细胞活性检测结果表明,L.casei LC2W能降低H.pylori SSl对MKN-45细胞的损伤。综上所述,L.casei LC2W对胃上皮细胞保护作用的强弱与其黏附能力有很大的相关性,L.casei LC2W可能通过黏附的竞争性占位效应,保护了细胞膜的完整性,使宿主细胞免受损伤。
再次,研究了L.casei LC2W的表面性质与黏附作用的关系。结果表明,L.caseiLC2W菌体具有疏水性和自聚合能力,黏附能力与疏水性存在很大的相关性;利用酶,化学物质和热对L.casei LC2W的菌体进行处理后,其表面疏水性和对MKN-45细胞的黏附性均有不同变化。表明L.casei LC2W的黏附作用是多种因素作用的结果,但蛋白类物质起主导作用,表明其黏附素的主要成分为蛋白质。
最后,利用5M氯化锂对L.casei LC2W细胞表面蛋白进行了提取。扫描电镜结果显示,抽提后细胞表面被破坏而细胞不破裂,其对MKN-45细胞黏附性降低,表明表面蛋白参与了L.casei LC2W对细胞的黏附。SDS-PAGE结果表明提取的表面蛋白由分子量为41.6、63.5、66.2 kDa的三种蛋白组成。采用葡聚糖凝胶G-75对表面蛋白进行初步分离,并测试其黏附能力。结果表明,分子量为41.6 kDa的表面蛋白组分可以明显增强经氯化锂处理过的菌体对MKN-45的黏附能力,表明该蛋白是参与L.casei LC2W黏附的配体蛋白。