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华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)因其贝壳色彩绚丽、营养丰富、味道鲜美、生长快、养殖周期短以及经济效益高等众多优良特性,自上世纪70年代就已经成为我国南方重要的海水养殖贝类。 华贵栉孔扇贝的贝壳颜色通常有橙色、橙紫色和褐色等,其闭壳肌绝大多数为白色,但本课题组通过多年选育,获得了一个贝壳和闭壳肌均为金黄色、富含类胡萝卜素并同时能够稳定遗传的新品系。目前对于该新品系富集类胡萝卜素的机制、类胡萝卜素的代谢以及代谢调控的机制等问题目前尚未明确。 视黄素受体(Retinoid Receptor),包括视黄酸受体(Retinotic Acid Receptor, RAR)和视黄素X受体(Retinoid X Receptor, RXR),其功能主要包括调节多条代谢途径,参与早期胚胎发育、性腺发育和生殖过程等。近年来在脊椎动物中的研究发现其在类胡萝卜素的代谢中具有调控作用。 本文首次在华贵栉孔扇贝克隆得到 RAR和RXR基因其部分亚型的cDNA全长,并进行了同源性分析、组织表达差异分析及其与类胡萝卜素含量关系的研究。主要结果如下: 1、RAR和RXR基因全长cDNA序列的克隆。结合同源克隆与RACE-PCR方法,克隆得到华贵栉孔扇RAR(CnRAR)和RXR(CnRXR)基因的全长cDNA序列并发现了其中部分亚型。RAR基因包括,CnRARa全长1958 bp(不包括Ploy A尾,下同)编码434个氨基酸残基;CnRARb全长1901 bp,较CnRARa少编码19个氨基酸。RXR基因包括,CnRXRa全长5480 bp,编码450个氨基酸残基;CnRXRb较CnRXRa缺失12个碱基;CnRXRc为CnRXRa的剪接亚型,全长4728 bp,共编码436个氨基酸残基;CnRXRd较CnRXRc缺失12个碱基。核定位信号预测发现华贵栉孔扇贝RARs和RXRs均定位于细胞核。取多个物种的视黄素基因做同源分析发现,华贵栉孔扇贝RAR蛋白先与同为双壳纲的太平洋牡蛎聚成一支,之后与其他贝类汇为一支,然后与脊索动物聚类。华贵栉孔扇贝 RXR蛋白先与同属扇贝科的栉孔扇贝亲缘关系最近,之后与其他贝类聚为一支,然后与脊索动物聚类,但与甲壳纲和昆虫纲进化距离较远。 2、RAR和RXR组织差异表达。采用实时荧光定量PCR技术检测华贵栉孔扇贝 RAR和RXR mRNA在不同组织中的表达特性。结果显示,CnRARs和CnRXRs广泛表达于各组织中,但具有一定的组织表达特异性,CnRARs在性腺中的表达量显著高于其他组织,在闭壳肌组织中次之。而 CnRXRs则在血液中大量表达,其次为闭壳肌。 3、RAR和RXR与类胡萝卜素含量关系。通过对扇贝体内的一个重要的类胡萝卜素吸收相关基因(清道夫受体蛋白样基因, SRB-like-3)进行RNA干扰,研究类胡萝卜素的变化对视黄素受体基因表达的影响。结果表明血液中CnRARs和CnRXRs的表达量随干扰处理时间的加长和类胡萝卜素浓度的降低而迅速上升,说明视黄素受体对类胡萝卜素浓度变化有较为迅速的响应。 本研究首次获得华贵栉孔扇贝RAR和RXR基因及其亚型的全长cDNA序列,同时研究了这两个基因的组织表达特性,为今后开展 RAR和RXR基因表达与调控的研究提供了理论基础;本文通过RNA干扰使得华贵栉孔扇贝类胡萝卜素含量产生变化,用于探讨其对RAR和RXR的影响,其结果侧面验证了RAR和RXR对类胡萝卜素的代谢具有调控作用。