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背景:心肌梗死(myocardialinfarction,MI)是死亡率和致残率极高的心血管疾病。尽管MI心脏的临床手术、介入和药物治疗发挥了重大作用,但MI仍然是全世界发病率和死亡率的主要原因,目前仍然缺乏有效治疗MI的特效药。MI导致心肌发生病理性重塑的机制研究取得了重大进展,但确切的分子机制尚未完全阐明,也阻碍了缺血性心脏病有效药物的研发。因此发现新靶点分子在MI心肌病理性重塑中的作用及其分子机制研究十分迫切。研究发现,长期缺氧引起心肌线粒体损伤是MI导致心力衰竭的主要原因,其分子机制尚未完全阐明。前期我们研究发现,线粒体特异性磷脂(心磷脂Cardiolipin,CL)参与正常线粒体的生物合成和功能维持,包括线粒体膜结构、线粒体分裂与融合的动态平衡、线粒体自噬以及氧化磷酸化水平。ALCAT1作为CL的酰基转移酶,催化CL的病理性重塑,使其富含异常酰基成分,如二十二碳六烯酸(DHA),并引起四亚油酰心磷脂(TLCL)的缺失,引起线粒体形态和功能紊乱。氧化应激诱导ALCAT1高表达是线粒体病变的主要原因,因此ALCAT1可通过催化CL病理性重塑,调控线粒体的形态和功能。目前缺乏ALCAT1的有效抑制剂,前期我们已经合成了该抑制剂。但在ALCAT1及其抑制剂在MI心肌病理性重塑中的作用及其分子机制研究,目前尚缺乏文献报道。目的:发现ALCAT1抑制剂和基因敲除对心梗心脏结构与功能重塑的改善作用以及对心梗心脏氧化应激、炎症和细胞凋亡的影响,揭示ALCAT1抑制剂和基因敲除对心梗心肌线粒体结构和功能紊乱的作用机制。方法:(1)ALCAT1-/-小鼠心梗实验:选取8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠(wild-type,WT)和制备ALCAT1-/-小鼠(KO),采用左冠状动脉前降支(left anterior de-scending coronary artery,LAD)永久性结扎手术制备心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型,假手术(Sham)组只穿线不结扎作为手术对照。两种基因型小鼠分组:假手术组(WT-Sham,KO-Sham)和心肌梗死组(WT-MI,KO-MI)。(2)ALCAT1抑制剂Dafa干预实验:WT小鼠进行LAD结扎手术后当天,灌胃安慰剂(5%CM-cellulose)或 ALCAT1 抑制剂(Dafa,10 mg/kg 体重),每天早晚2次持续灌胃4 wk。药物干预小鼠分组:假手术组(Sham)、心肌梗死+安慰剂组(Vehicle)和心肌梗死+药物干预组(Dafa)。(3)体外细胞实验:采用H9c2心肌细胞构建ALCAT1过表达(AL)和CRISPR/cas9-ALCAT1-/-(KO)细胞系,并采用低氧(1%O2,5%CO2)处理诱导缺氧状态,采用ALCAT1抑制剂Dafa或线粒体特异性抗氧化剂Mit Q等试剂干预,vector(Vec)为对照。原代乳鼠心肌细胞培养:分离出生1-3 d的WT和ALCA1-/-乳鼠心脏心肌细胞,培养3-5 d,细胞密度达80-90%后,低氧(1%O2,5%CO2)处理诱导缺氧状态,采用ALCAT1抑制剂Dafa或线粒体特异性抗氧化剂Mit Q试剂干预。(4)检测指标:心动超声评定心功能,WGA染色观测心肌细胞肥大程度,Masson和WGA染色观察分析心肌胶原容积百分比(CVF%),脂质组学分析CL成分变化,透射电镜观察分析线粒体形态,TUNEL染色分析细胞凋亡,线粒体胞质分离技术检测分析DRP1线粒体转移,Seahorse检测OCR分析线粒体功能,Western Blot 检测ALCAT1、HIF-1α、HIF-1β、VHL、TXNIP、NLRP3、Bax、C-casp3、DRP1、OPA1、MFN1 和 MFN2 蛋白表达,RT-qPCR 检测Anf、Bnp、β-Mhc、Col1a1、Col3a1、Tnf、Nfkb、Il-1b 和 Il-6 基因表达。结果:(1)动物生存统计与心脏质量测量、心动超声检测和WGA免疫荧光染色观察分析结果显示,ALCA T1基因敲除和Dafa干预心梗小鼠的左心室后壁厚度和室间隔厚度、左心室体积、心肌细胞横截面积、HW/BW 比值和死亡率均显著降低(P<0.01)。表明ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa均显著改善心梗小鼠左心室病理性肥厚。(2)心动超声检测结果显示,ALCAT1基因敲除和Dafa干预心梗小鼠心脏的LVEF、LVFS、LVPWd、LVPWs、IVSd、IVSs 和 HR 显著升高(P<0.01),LV volume s、LV volume d、LVIDd 和 LVIDs 显著降低(P<0.01)。表明ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa均显著改善心梗小鼠左心室舒缩功能。(3)心肌细胞收缩蛋白和分泌功能检测结果显示,ALCAT1基因敲除和Dafa干预心梗小鼠心肌的Anf、Bnp和β-Mhc基因表达显著下调(P<0.01)。表明ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预,均显著减轻心肌功能障碍。(4)Masson染色与RT-qPCR观察与检测结果显示,ALCA T1基因敲除和Dafa干预心梗小鼠CVF%、Col1a1和Col3a1基因水平均显著降低(P<0.01)。表明ALCAT1基因敲除或者ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著改善心梗心肌纤维化。(5)Western blot检测结果显示,ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著降低小鼠心肌ALCAT1、HIF-1α和HIF-1β表达水平(P<0.01),显著升高VHL表达水平(P<0.01)。表明ALCAT1在抑制心梗心肌HIF-1α和HIF-1β表达并促进VHL表达中发挥重要作用。(6)Elisa试剂盒检测结果显示,ALCA T1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著降低小鼠心肌组织H2O2和MDA水平(P<0.01)。表明ALCAT1在抑制心梗心肌氧化应激和脂质过氧化中发挥重要作用。(7)Western blot和RT-qPCR检测结果显示,ALCA T1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著降低心肌组织TXNIP和NLRP3蛋白表达(P<0.01),Tnf、Nfkb、Il-1b和Il-6基因表达(P<0.01)。表明ALCAT1在抑制心梗心肌炎症反应中发挥重要作用。(8)Western blot和TUNEL检测结果显示,ALCA T1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著降低小鼠心心肌Bax和C-cas3蛋白表达(P<0.01,P<0.05),降低心肌组织细胞凋亡(P<0.01)。表明ALCAT1在抑制心梗心肌细胞凋亡中发挥重要作用。(9)透射电镜观察和RT-qPCR检测mtDNA拷贝数结果显示,ALCA T1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著减轻心梗小鼠心肌线粒体碎片化、肿胀、排列紊乱、肌节紊乱及丢失等现象,线粒体面积显著变大,肌节长度显著延长,mtDNA拷贝数显著增加(P<0.01)。表明ALCAT1具有减轻心梗心肌线粒体病理性重塑的作用。(10)CS试剂盒和Seahorse检测OCR结果显示,ALCA T1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著升高心梗小鼠心肌CS含量和OCR水平(P<0.01,P<0.05)。表明ALCAT1基因敲除或者ALCAT1抑制剂Dafa显著降低心梗心肌线粒体呼吸功能紊乱。(11)Western Blot结果显示,ALCA T1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著降低心梗小鼠心肌DRP1、OPA1、MFN1和MFN2表达(P<0.01)。表明ALCAT1显著改善心梗心肌线粒体动态变化,降低线粒体过度分裂和融合。(12)心肌线粒体和细胞质DRP1分布变化的Western Blot蛋白检测结果显示,ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著降低心梗小鼠心肌线粒体DRP1蛋白表达(P<0.01),升高心肌细胞质DRP1蛋白表达(P<0.01)。表明ALCA T1基因敲除或者ALCAT1抑制剂Dafa显著抑制DRP1的线粒体外膜转位,降低线粒体过度分裂。(13)脂质组学分析结果显示,ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预均显著升高心梗小鼠心肌TLCL水平(P<0.01,P<0.05),降低DHA水平(P<0.01)。表明ALCAT1基因敲除或者ALCAT1抑制剂Dafa不仅恢复心梗心肌TLCL水平,同时显著降低CL中DHA含量。(14)H9c2细胞HIF-1α表达的Western Blot检测结果显示,过表达ALCAT1加低氧干预、低浓度Mito Q加低氧干预均显著升高HIF-1α蛋白表达;ALCAT1基因敲除加低氧干预、ALCAT1抑制剂Dafa加低氧干预均显著下调HIF-1α蛋白表达。乳鼠原代心肌细胞HIF-1α蛋白表达的Western Blot检测结果显示,低氧条件下ALCA T1基因敲除或Mito Q或Dafa干预均未检测到HIF-1α蛋白表达。表明H9c2和原代心肌细胞在缺氧干预条件下,ALCAT1抑制剂Dafa与线粒体靶向抗氧化剂Mito Q的作用无差异。结论:(1)ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa干预,均显著降低心梗小鼠死亡率、心脏病理性肥厚和心肌纤维化,改善心梗心脏的舒/缩功能;ALCAT1抑制剂Dafa在逆转缺血心脏的病理性重塑中具有潜在的应用价值。(2)ALCAT1基因敲除或ALCAT1抑制剂Dafa显著降低心梗心肌HIF-1α的表达,抑制心梗导致的心肌氧化应激和脂质过氧化损伤,逆转炎症反应和心肌组织细胞凋亡;发现ALCAT1抑制剂Dafa具有缺血心脏保护的作用。(3)ALCAT1基因敲除或者ALCAT1抑制剂Dafa可显著抑制DRP1线粒体外膜转位,恢复心梗心肌TLCL水平,显著降低CL中DHA含量,抑制低氧诱导的HIF-1α蛋白表达,降低心梗心肌线粒体病理性重塑和功能紊乱,是ALCAT1保护心梗病理性重塑的重要机制。综上表明,抑制ALCAT1可有效抑制心梗心肌组织炎症和氧化应激损伤与细胞凋亡,改善心梗心脏结构与功能的病理性重塑。抑制DRP1线粒体外膜转位,恢复心梗心肌TLCL水平,显著降低CL中DHA含量,抑制低氧诱导的HIF-1α蛋白表达,降低心梗心肌线粒体病理性重塑和功能紊乱,是ALCAT1改善心梗病理性重塑的重要机制。