背景与目的过继性细胞治疗逐渐成为晚期恶性肿瘤治疗的一种重要选择。然而,如何从肿瘤组织或外周血中高效扩增肿瘤抗原特异性T淋巴细胞依然是限制该领域发展的瓶颈。研究显示肿瘤组织或外周血中CD8⁺PD-1⁺T细胞亚群包含的肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的比例和数量远高于CD8⁺PD-1^-T淋巴细胞。然而,PD-1⁺T细胞处于耗竭状态,增殖能力弱,常规培养会使该亚群细胞处于增殖劣势。因此,体外恢复CD8⁺PD-1⁺抗原特异性T淋巴细胞的功能并实现该亚群的大量扩增成为优化过继细胞免疫治疗的关键。本研究旨在构建具有抗PD-1抗体和IL-15/IL-15Rα双重功能的融合蛋白anti-PD-1/IL-15/IL-15Rα[简称PD-S15,其包含抗PD-1特异性单链抗体（scFv）、IL-15及IL-15Rα的sushi结构域的融合蛋白],体外探讨其靶向结合PD-1的能力及其对NK/T细胞增殖能力的影响,为后续从肿瘤组织内甚至外周血中选择性扩增CD8⁺PD-1⁺抗原特异性T淋巴细胞奠定基础。方法1.人工合成人anti-PD-1（scFv）基因和人IL-15/IL-15Rα融合基因序列,分别克隆至pUC57中,两目的基因序列经过酶切连接构建重组表达质粒pUC57-PD-S15,然后对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。2.采用脂质体法将pUC57-PD-S15质粒转染至HEK293T细胞中,收获细胞培养上清液,Western blot技术检测细胞培养上清液中PD-S15融合蛋白的表达,同等条件下转染空载体pUC57的细胞培养上清液作为对照。3.提取3例肿瘤患者来源的外周血单个核细胞（PBMC）,同一供体来源的PBMC同等条件下分别采用空载体pUC57/X-VIVO^TM15培养液和PD-S15/X-VIVO^TM15培养液孵育,然后利用流式细胞术检测PD-S15融合蛋白体外靶向结合PD-1的能力。4.提取3例肿瘤患者来源的PBMC,标记CFSE,显微镜观察和流式细胞术检测不同配比的PD-S15/X-VIVO^TM15培养液（1:19,1:9,1:4,1:1）对PBMC增殖能力的影响,1:1配比的空载体pUC57/X-VIVO^TM15培养液作为对照;此外,分别在培养前（第0天）和第5天增殖现象最佳孔利用流式细胞术检测CD3⁺CD8⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3^-CD56⁺（NK）各免疫表型比例的变化。5.提取3例肝癌患者来源的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）,显微镜观察和细胞计数法分析经典TIL培养方案和1:1配比的PD-S15/X-VIVO^TM15培养液对TIL增殖能力的影响。6.2⁵实验均独立重复3次。采用SPSS21.0统计学软件对数据进行分析。计量数据以x±s表示,两组间比较采用配对的t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.pUC57-PD-S15重组质粒经双酶切和测序验证构建成功并成功转染HEK293T细胞,Western blot测定目标蛋白相对分子量大约为55kD,符合预期;转染空载体pUC57的细胞培养液上清未检测出相应的蛋白条带。2.流式细胞学检测结果显示PD-S15/X-VIVO^TM15培养液孵育PBMC,几乎封闭了所有细胞表面的PD-1的位点;相反空载体pUC57/X-VIVO^TM15培养液不能封闭细胞表面的PD-1位点。3.显微镜观察和流式细胞学检测结果均显示PD-S15融合蛋白体外能够刺激PBMC活化增殖（P<0.05）,并呈现浓度依赖性（1:19 vs 1:9,P<0.05;1:9 vs 1:4,P<0.01;1:4 vs 1:1,P>0.05）,PD-S15浓度越高,PBMC增殖能力越强。第5天免疫表型分析显示CD3⁺CD8⁺T细胞比例较培养前升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,CD3^-CD56⁺（NK）细胞比例较培养前无统计学差异（P>0.05）,CD3⁺CD4⁺T细胞比例较培养前无统计学差异（P>0.05）。4.显微镜观察和细胞计数结果显示PD-S15培养方案体外活化扩增T淋巴细胞的效能优于经典TIL培养方案（P<0.01）。结论本研究成功制备了一种新型的双功能融合蛋白PD-S15,并初步证明了该融合蛋白体外能够靶向结合PD-1分子并快速扩增NK/T细胞,为后续从肿瘤组织内甚至外周血中选择性扩增CD8⁺PD-1⁺抗原特异性T细胞奠定了基础。