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球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一种丝状昆虫病原真菌,在害虫的生物防治方面具有巨大的潜力。自噬是真核生物中一种保守的细胞内降解机制,与丝状真菌的多种生物学过程有关,例如营养生长、细胞发育和毒力等。本研究旨在揭示球孢白僵菌自噬过程中的调控机制和生化途径。BbAtg1蛋白激酶的磷酸化调控功能与机制解析自噬是真核生物中一种保守的胞内降解机制,由蛋白激酶即自噬相关蛋白1（Atg1）启动。然而,除了Atg1的自磷酸化活性外,在丝状真菌中绝大部分被Atg1磷酸化的靶蛋白是未知的。在球孢白僵菌中,本研究采用比较组学的分析方法得到以下结果,BbAtg1在分生孢子发生过程中对总蛋白质组和磷酸化蛋白质组具有关键影响。就其生理功能而言,BbAtg1介导的磷酸化蛋白质组主要与代谢、信号转导、细胞周期和自噬有关。在蛋白质水平上,BbAtg1主要调控参与蛋白质合成、蛋白质命运和蛋白质结合功能的蛋白。此外,磷酸化蛋白质组学和蛋白质组学数据的综合分析指示,球孢白僵菌体内存在受BbAtg1磷酸化活性调节的多个与自噬过程相关的潜在靶蛋白。其中,本研究证明了BbAtg1可磷酸化自噬过程中类泛素连接系统的重要组成部分BbAtg3。我们的研究结果表明,除了作为自噬启动的关键组成部分外,Atg1通过其磷酸化活性协调自噬体的延伸。本研究将有助于未来对Atg1非经典靶标的研究,并破译Atg1介导的磷酸化调控网络。类泛素连接系统中BbATG7和BbATG10基因功能解析本研究在昆虫病原真菌球孢白僵菌中鉴定了类泛素连接系统中的类泛素酶Atg7和Atg10,并进行了功能分析。BbAtg7和BbAtg10存在相似的生物学功能。在ΔBbatg7和ΔBbatg10菌株中均观察到自噬过程受阻现象。两个敲除菌株在以几丁质为单一氮源的培养基上显示生长受损。在营养丰富的培养基上,两个基因各自的缺失对营养生长没有显著影响,但对真菌的产孢能力和抗逆性造成了严重影响。其中,ΔBbatg7敲除株的分生孢子产量（下降了71.6%）和芽生孢子产量（下降了61.1%）显著降低,而ΔBbatg10的分生孢子产量下降则更为剧烈,为95.6%。此外,ΔBbatg7对甲萘醌和刚果红的应激敏感性增加,而ΔBbatg10仅对甲萘醌胁迫敏感。在体表浸泡和血腔内注射试验中表明,ΔBbatg7菌株的毒力显著减弱。研究结果表明,BbAtg7和BbAtg10均参与真菌的自噬途径,且在感染周期中发挥额外的非自噬功能,参与调节球孢白僵菌的发育和毒力。BbPEX14基因功能解析本研究鉴定并在功能上解析了过氧化物酶体膜上重要的停泊蛋白BbPex14的生物学功能。BbPex14参与过氧化物酶体中依赖PTS1途径的基质蛋白输入过程。BbPEX14基因的缺失导致球孢白僵菌的发育,抗逆性,致病力等各个生理过程产生严重的功能缺陷。相比野生型菌株而言,ΔBbpex14敲除株的芽生孢子产量下降了57.3%,分生孢子产量下降了97.6%,且无法形成产孢结构;在毒力测定中,ΔBbpex14敲除株在以血腔注射的方式感染宿主时,其LT50与野生株相比延长了2.8 d;在体壁侵染中,当野生株感染的大蜡螟全部死亡时,ΔBbpex14敲除株只造成了宿主11.1%的死亡率。根据质谱数据的分析显示,BbPex14中五个赖氨酸残基为泛素化修饰位点。点突变分析表明,BbPex14中两个位点（K139,K155）显著参与了分生孢子和芽生孢子的产生。这些结果表明BbPex14在球孢白僵菌的生物学过程中起着重要作用,其中BbPex14在产孢过程中的功能受蛋白翻译后修饰的调节。BbPex14介导过氧化物酶体选择性自噬本研究发现BbPex14介导球孢白僵菌的过氧化物酶体选择性自噬。酵母双杂交法用于筛选BbPex14的潜在相互作用蛋白,其中一种蛋白质的编码基因被鉴定为靠近BRCA基因1（NBR1）。Bb Nbr1参与球孢白僵菌的发育和致病过程。与野生株相比,Bb Nbr1的缺失导致真菌的分生孢子产量下降了55.2%,芽生孢子产量下降了36.3%,体壁侵染方式中的LT50延长了1.02 d。同时,Bb Nbr1的缺失阻断了球孢白僵菌中的过氧化物酶体自噬。生物信息学分析表明Bb Nbr1含有与Atg8相互作用的基序。Bb Nbr1和BbAtg8之间的相互作用通过系列的蛋白质互作实验得到验证。因此,我们提出了球孢白僵菌中以BbPex14为过氧化物酶体上的配体蛋白,Bb Nbr1为选择性自噬受体,BbAtg8为自噬体上锚定受体的过氧化物酶体选择性自噬模型。这是丝状真菌中第一个揭示了过氧化物酶体自噬途径的研究。过氧化物酶体定位蛋白Bb Scp2的生物学功能解析固醇载体蛋白2（Scp2）是一类可以结合多种脂质分子的脂类载体蛋白。本研究解析了球孢白僵菌的SCP2基因（Bb SCP2）的功能。亚细胞定位显示Bb Scp2主要定位于过氧化物酶体。脂类结合实验显示Bb Scp2对各种脂质的亲和力各有差别,其中对棕榈酸（PA）和麦角甾醇（ES）具有很强的亲和力,而对油酸（OA）和亚油酸（LA）的结合活性较弱。Bb SCP2的缺失并未显著影响真菌在各种碳源上的营养生长,但导致其分生孢子（下降49%）和芽生孢子（下降45%）的产量部分减少。外源脂质可以部分恢复ΔBbscp2敲除株的分生孢子产量缺陷。Bb Scp2参与萌发过程中细胞膜的完整性,其敲除后导致球孢白僵菌毒力下降。此外,相比体腔注射方式,基因缺失菌株在体壁侵染方式中的毒力下降更为显著。总之,本研究结果表明Bb Scp2定位于过氧化物酶体,由该蛋白参与的脂质运输对球孢白僵菌的无性发育及毒力均有贡献。总之,除了诱导自噬发生的功能外,Atg1还介导了球孢白僵菌中的全局蛋白质组和磷酸化蛋白质组,并对自噬过程中的类泛素连接系统进行正反馈控制。过氧化物酶体蛋白参与球孢白僵菌的发育,胁迫响应和致病过程。更为重要的是,三种蛋白（Pex14、Nbr1和Atg8）形成了介导过氧化物酶体选择性降解的3步途径。这项研究更新了我们对昆虫病原真菌的生理过程和自噬途径所涉及的机制的理解。