论文部分内容阅读
目的热休克蛋白gp96作为分子伴侣,能够与肿瘤抗原肽形成gp96—肽复合物,参与肿瘤抗原向MHC-I类分子途径的递呈过程,从而激活CD8+T淋巴细胞,产生抗肿瘤特异性免疫应答。因此,gp96—肽复合物疫苗为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。传统制备gp96的方法虽然已经成熟,但是由于组织来源的限制以及纯化工序过于繁杂,难以进行工业化生产。因此寻找一种快速有效而又高度特异性的方法纯化gp96,成为该疫苗大规模临床应用所要解决的首要问题。研究进一步证实,在gp96—肽复合物中起肿瘤免疫作用的是抗原肽,不是gp96自身,gp96结合的多肽才是疫苗制备和诱导特异性免疫应答的分子基础。因此,对gp96结合肽库的鉴定和分析,成为构建gp96—肽复合物疫苗、探讨相关作用机理及疫苗人工化生产等急待解决的问题。方法用固相化的gp96蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗gp96蛋白Fab抗体的阳性克隆,酶切及连接反应构建其可溶性表达噬菌粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导特异性抗体的高效表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性及特异性；所得抗体经纯化后作为偶联配体,吸附纯化膀胱癌及其癌旁组织中的gp96—肽复合物；通过酸洗脱法得到gp96所结合的多肽片段,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其分子量及氨基酸序列；应用生物信息学技术分析各多肽片段的生物学特性。结果1通过对人天然Fab段噬菌体抗体库的四轮淘选,特异性抗gp96蛋白Fab噬菌体抗体得到了富集；2构建的抗gp96可溶性Fab抗体表达载体,在IPTG的诱导下得到了抗体的高效表达；进一步应用亲和层析技术得到了纯化的抗gp96可溶性Fab抗体；3利用基因工程抗体技术结合免疫亲和层析技术,可以从少量膀胱组织中纯化出实验用量的gp96—肽复合物,每克组织可获得约20μg-50μ.g的gp96—肽复合物；4在膀胱癌及其癌旁组织来源的gp96结合的多肽中,14条多肽的氨基酸序列被鉴定,其中8条来源于膀胱癌,6条来源于癌旁组织,分子量在997.5281Da-2211.33Da之间：5条多肽具有明确的蛋白来源,5条多肽经鉴定具有抗原性。结论1利用基因工程抗体技术结合免疫亲和层析技术,可成功的从有限的组织中分离纯化出实验用量的gp96—肽复合物；2gp96结合肽库中的肽为一些小分子肽片段,长短不一,部分蛋白来源明确,部分多肽具有抗原性,具有潜在的临床应用价值。