【摘 要】
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通过实验室定向进化,将野生型酶改造为具有更高耐热性能的工业催化剂,已经成为蛋白质工程的一个重要目标。目前,基于已有的序列与结构认知,已成功使用多种计算设计策略设计热稳定性酶变体。然而,酶结构的显著灵活性以及酶催化的高度复杂性使得酶在热稳定性改造过程中通常以酶活性的损失为代价,大大降低了酶工业改造与应用的有效性。因此,在获得稳定性提高的同时,保持突变体酶的功能活性不受损失,是热稳定性改造过程中的重要
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通过实验室定向进化,将野生型酶改造为具有更高耐热性能的工业催化剂,已经成为蛋白质工程的一个重要目标。目前,基于已有的序列与结构认知,已成功使用多种计算设计策略设计热稳定性酶变体。然而,酶结构的显著灵活性以及酶催化的高度复杂性使得酶在热稳定性改造过程中通常以酶活性的损失为代价,大大降低了酶工业改造与应用的有效性。因此,在获得稳定性提高的同时,保持突变体酶的功能活性不受损失,是热稳定性改造过程中的重要任务。本论文选取枯草芽孢杆菌脂肪酶A(Bacillus subtilis Lipase A,BSLA)作为模型蛋白,借助计算设计改造热稳定性突变体;并引入构象动力学分析方法,探究热稳定性及酶活性与构象变化的关系;进一步结合动力学特征参数辅助突变体的优化筛选以及突变的有效组合设计,帮助实现酶在工业生产中的高效率与低成本应用。主要研究内容如下:(1)通过PROSS(Protein Repair One Stop Shop)蛋白质修复在线设计平台得到热稳定性提升的7个组合突变体,最优突变体D7的热熔融温度相对于野生型提高13.6℃,相对酶活性为野生型的106.4%。基于分子动力学模拟的局部作用力分析表明,相互作用的引入以及表面亲水性的改善是热稳定性提高的主要分子机制。与此同时,活性位点区域中催化三联体氢键网络的破坏与关键结合位点残基S77非活性构象的增加是导致相对酶活性下降的原因。(2)基于动态互相关性网络的最短相关性距离分析,探究了远端突变位点对酶活性位点的变构调控机制。将与活性区域残基具有更小最短相关性距离的残基进行筛除,优化后突变体RD3的热熔融温度相对酶活性提高至野生型的149.6%。(3)进一步针对PROSS策略获得的13个突变,选取其中4个性质较优的突变位点A15S、F17S、G155S、I157M进行全路径迭代组合突变,其中四点组合突变热熔融温度相对于野生型提高10.51℃,相对酶活性为118%。与相邻残基的上位性相互作用以及对表面疏水堆积的改善可能分别是组合突变体显示出负上位性效应和正上位性效应的原因。(4)基于(1)(2)(3)中的讨论,将定向进化中筛选的15个阳性单点作为突变文库,通过选取热稳定性贡献、结构信息以及构象动力学特征等七个维度的参数,使用K均值聚类分析,将数据点聚类为多个具有相似特征的数据点的簇。包含9个突变位点的C31突变体热熔融温度相对于野生型提高约23℃,该方法可以有效地用于突变的组合设计,提高改造效率。本研究通过将计算模拟与实验验证相结合,设计获得了热稳定性提升的BSLA突变体。同时,本研究通过构象动力学分析探究了对蛋白质稳定性及其酶活性与构象变化的关联性,并提供了对突变体设计进行优化的多种可行性方法。
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