论文部分内容阅读
研究目的肝癌是全球发病率第五位、死亡率第二位的常见恶性肿瘤。包括我国在内的东亚、东南亚部分国家和地区是肝癌高发区,每年新增病例占全球总数的50%以上。通过影像学检查与肿瘤标志物的测定,对肝癌进行早期诊断排查是控制疾病的有利措施。而对于已确诊的患者,手术切除、肝脏移植、介入治疗则是其首选治疗方案。但是,由于肝癌的高复发率、高转移率、预后不佳,患者术后5年的生存率仍低于10%。因此,急需进一步完善肝癌理论,阐明其发病机制,为临床肝癌治疗提供新的导向和依据。Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)是广泛表达在免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞)上的重要模式识别受体,在机体抵御外来微生物感染的天然免疫应答过程中发挥了重要作用,并间接参与调节适应性免疫应答。然而,越来越多的研究证实,TLRs亦在肿瘤细胞中广泛表达,而且其功能因肿瘤类型及TLRs类别的不同而有所差异。研究认为,多数肿瘤细胞表面TLR4的活化对于肿瘤的发生发展起到正向的促进作用。但是,关于肝癌表面TLR4的生物学功能的文献报道极少。临床数据显示,绝大多数慢性肝脏疾病患者体内存在肠道菌群失调的现象。在动物模型中进行的研究发现,肠道有害菌的自身成分脂多糖(LPS)通过激活肝细胞的TLR4信号通路促进了肝癌的发展。这些研究结果提示,肠道微生态紊乱与肝癌的发生发展或许存在一定关系,TLR4在这个过程中可能发挥了重要作用。基于上述现象,本研究利用分子生物学手段,通过大量体外实验,研究了TLR4激动剂LPS对肝癌细胞的肿瘤生物学影响,并阐明其内在机制,初步探讨了阻断TLR4用于肝癌辅助治疗的可行性,为临床肝癌治疗及新型靶向治疗药物的研发提供有益参考。研究方法1.以几种常见的人和鼠肝癌细胞系为模型,采用半定量RT-PCR法检测TLRs mRNA的表达水平；通过western-blot实验及荧光定量PCR法检测肝癌细胞表面的TLR4是否是功能性表达；2.采用WST-1法、细胞平板克隆实验检测LPS对肝癌细胞增殖能力的影响；PI单染、Annexin V/PI双染法分别检测LPS对人肝癌细胞系H7402细胞周期、凋亡的影响；荧光定量PCR及western blot实验检测细胞周期蛋白CyclinD1的表达变化；3.Vestern-blot检测LPS对H7402细胞中STAT3通路活化的影响；荧光素酶报告基因技术检测LPS对STAT3转录活性的影响；利用Decoy ODN及STAT3抑制剂对该通路进行抑制后,WST-1法检测LPS对肝癌细胞增殖能力的影响。4.LPS刺激H7402细胞后,荧光定量PCR检测COX-2、PGE2受体(EP1,2,3,4)的表达；ELISA检测肝癌细胞PGE2分泌水平；Western blot检测抑制TLR4前后,LPS对COX-2的蛋白水平表达的影响；抑制COX-2活性或阻断PGE2受体后,western-blot检测LPS对STAT3通路活化的影响；5.荧光定量PCR及western blot实验检测LPS刺激H7402细胞后,耐药基因Mdr-1及蛋白p-gp表达变化；抑制COX-2活性后,western-blot检测LPS对P-gp表达的影响；采用荧光素酶报告基因技术,检测STAT3在LPS诱导肝癌耐药过程中的作用；6.免疫组织化学方法检测原发性肝癌患者癌及癌旁部位TLR4、COX-2、 P-STAT3的表达情况；7.LPS预处理肝癌细胞后,WST-1法检测肿瘤化疗药物5-FU及DOX对H7402细胞杀伤活性的影响；流式细胞术检测LPS对H7402细胞药物摄取的影响。研究结果1.多数TLRs在肝癌细胞中均有表达,其中LPS刺激可以上调TLR4mRNA及蛋白水平,并活化TLR4下游NF-κB信号通路,介导炎症因子IL-6,IL-8,TNF-α的产生,说明TLR4在肝癌细胞中功能性表达。2.LPS显著增强肝癌细胞的增殖能力,对H7402细胞的作用最为明显。LPS刺激下细胞周期调控蛋白CyclinD1表达升高,促进H7402细胞周期由G1期向S期过渡,但对凋亡无影响。3.LPS能够激活H7402细胞中STAT3信号通路,同时STAT3启动活性明显增强；阻断或抑制STAT3后,LPS对肝癌细胞促增殖能力明显减弱。4.LPS刺激肝癌细胞后,COX-2、PGE2及PGE2受体表达升高。TLR4被抑制或STAT3被抑制后,COX-2的表达水平明显降低；反之,COX-2被抑制后,LPS亦无法活化STAT3通路。说明在LPS的刺激作用下,COX-2/PGE2与STAT3形成正反馈通路。5.LPS刺激后,H7402细胞耐药基因Mdr-1表达升高,蛋白P-gp水平升高,STAT3通路在LPS诱导细胞耐药过程中发挥重要作用。6.肝癌患者癌组织中TLR4、COX-2、p-STAT3三种蛋白分子呈现高表达,且明显高于癌旁组织。7.阻断TLR4可以抑制LPS诱导的H7402细胞对5-FU及DOX杀伤的抵抗,促进肝癌细胞对DOX的摄取能力。结论及意义本文首次对肝癌细胞TLR4的功能进行研究,并阐明了其内在机制,发现TLR4激动剂LPS通过激活COX-2/PGE2信号轴,进而激活STAT3通路,介导了肝癌细胞的增殖及多药耐药的产生；同时,研究结果进一步支持了“肠道微生态与肝癌发生发展之间存在关系”这一观点。提示在临床肝癌治疗中,采取一定措施改善肠道微生态或许有助于肝癌的辅助治疗及预后。此外,TLR4可能作为新的药物靶点,靶向TLR4的小分子拮抗剂或许可以成为肝癌治疗的新药物。