论文部分内容阅读
医学标志物(Marker)指的是为了诊断、预防和治疗人类疾病或评价人类健康时，用以进行生物、微生物、血清、化学、免疫血液、血液、生物物理、细胞病理等检验的人体物质。主要为来自人体组织、血液、尿液、粪便、浆膜腔液、脑脊液等多种体液和分泌物标本中的细胞和其他有形成份。本文主要选取了两种标志物，分别为糖基化血红蛋白HbA1c和血清人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,hCG)。HbA1c是世界卫生组织和许多国家糖尿病协会推荐的糖尿病首选诊断标准。hCG在临床诊断上主要作为诊断妊娠、异位妊娠、唐氏综合征、滋养层肿瘤等疾病的标志物。另一方面，本文主要使用配备光电二极管阵列检测器（Diode array detector，DAD）的毛细管电泳仪（Capillary electrophoresis，CE）分别对这两种标志物进行分离检测。本课题重点在于利用毛细管电泳的消耗试剂少、分离效率高及分离能力强的特点来开发可以应用于临床上的标志物检测方法。在方法开发中，本文着重探究背景缓冲溶液中各个组分在电泳过程中起到的作用并加以总结；同时将本文开发的方法同其他检测方法进行比较，并将比较的结果以及对实际样品分析的结果作为方法评价的依据。最后，本文还尝试探索在使用电容耦合非接触电导检测器（Capacitively coupled contactless conductivity detection，C4D）的条件下，分离检测上述两种标志物。
第一章主要先介绍了毛细管电泳的发展历史、基础理论、仪器的基本构造以及在实际开发电泳方法过程中可能采用的分离模式、进样模式和检测模式。之后介绍了本课题研究的第一个医学标志物即糖基化血红蛋白HbA1c，主要从其结构和种类入手，再介绍了其目前在临床诊断上的应用和检测手法的优缺点，提出了毛细管电泳在分离检测HbA1c时可以分离出血红蛋白变异体的优势。此后介绍了另一个医学标志物即hCG，先介绍其结构和种类，再介绍了其目前在临床诊断上的应用和检测手法。最后简述了本课题的研究目的和意义。
第二章开发了糖基化血红蛋白HbA1c的毛细管电泳检测方法。通过对背景缓冲溶液中各组分浓度的优化，重点分析了硼砂和HbA1c的结合原理并计算在该电泳体系条件下的结合常数。此外，还分析了亚精胺在电泳过程中对毛细管壁的影响并研究了不同亚精胺浓度下电渗流（Electroosmotic flow,EOF）的变化。最终得到的最佳电泳分离条件为75mmol/L的CHES,60mmol/L的硼砂，4.5mmol/L的亚精胺和1.0%(w/v)的聚乙二醇，其中pH值为9.8(用1mol/L的NaOH来调节),25mbar的进样压力下进样10s，分离电压为+15kV,检测波长为415nm。该方法和法国Sebia公司的电泳方法结果差异小于0.6%，与此同时还成功地分离出了含有血红蛋白变异体地实际样品。本章开发的电泳方法性能与商品化电泳试剂盒性能接近。
第三章开发了人绒毛膜促性腺激素β-hCG的毛细管电泳检测方法。通过对背景电解质缓冲溶液种类和浓度的优化，重点探究了葡聚糖对游离抗体和抗原抗体复合物分离度的影响，同时对比了不同抗原抗体反应比例的电泳结果和平板凝胶电泳的结果，并对不同比例的复合物峰面积进行了线性拟合，发现其线性相关，线性相关系数约为0.98。最终得到的最佳电泳条件为100mmol/L Tris-HCl pH=9.0；进样条件：0.5psi5s；分离电压：15kV；检测波长：200nm；毛细管：有效长度50cm，75μm内径。该方法的线性范围为9.286μg/ml-154.8μg/ml，近似等于41IU/ml-687IU/ml，线性相关系数为0.99941，最低检出限约为5.4ug/ml，峰面积的RSD为5.693%（n=5），迁移时间RSD为2.84%（n=5）。本章的电泳开发过程为使用能避免基质干扰的毛细管电泳联合高灵敏检测器提供了思路和借鉴。
第四章中初步探索了两种标志物的毛细管电泳联合电容耦合非接触电导检测器的检测方法。使用电泳条件为400mmol/L乙酸溶液，pH=2.62；进样：20mbar10s；分离电压：15kV；UV检测波长：415nm；C4D激发电压和频率：1200kHz40%vpp检测血红蛋白。通过对比紫外检测器和电导检测器的结果，血红蛋白在电导检测器中的信号峰被确认。使用电泳条件为20mmol/LNaH2PO4溶液，pH=5.0(用NaOH调节pH)；进样条件：20mbar10s；分离电压：15kV；C4D激发电压和频率：600kHz60%vpp；毛细管有效长度45.8cm，75μm内径来检测β-hCG的抗体。通过改变抗体浓度，确认了其在电导检测器中的信号峰位置。本章节的结果证明了毛细管电泳结合非接触电导检测器检测这两种标志物的可行性。
第五章为本课题的结论与展望。
第一章主要先介绍了毛细管电泳的发展历史、基础理论、仪器的基本构造以及在实际开发电泳方法过程中可能采用的分离模式、进样模式和检测模式。之后介绍了本课题研究的第一个医学标志物即糖基化血红蛋白HbA1c，主要从其结构和种类入手，再介绍了其目前在临床诊断上的应用和检测手法的优缺点，提出了毛细管电泳在分离检测HbA1c时可以分离出血红蛋白变异体的优势。此后介绍了另一个医学标志物即hCG，先介绍其结构和种类，再介绍了其目前在临床诊断上的应用和检测手法。最后简述了本课题的研究目的和意义。
第二章开发了糖基化血红蛋白HbA1c的毛细管电泳检测方法。通过对背景缓冲溶液中各组分浓度的优化，重点分析了硼砂和HbA1c的结合原理并计算在该电泳体系条件下的结合常数。此外，还分析了亚精胺在电泳过程中对毛细管壁的影响并研究了不同亚精胺浓度下电渗流（Electroosmotic flow,EOF）的变化。最终得到的最佳电泳分离条件为75mmol/L的CHES,60mmol/L的硼砂，4.5mmol/L的亚精胺和1.0%(w/v)的聚乙二醇，其中pH值为9.8(用1mol/L的NaOH来调节),25mbar的进样压力下进样10s，分离电压为+15kV,检测波长为415nm。该方法和法国Sebia公司的电泳方法结果差异小于0.6%，与此同时还成功地分离出了含有血红蛋白变异体地实际样品。本章开发的电泳方法性能与商品化电泳试剂盒性能接近。
第三章开发了人绒毛膜促性腺激素β-hCG的毛细管电泳检测方法。通过对背景电解质缓冲溶液种类和浓度的优化，重点探究了葡聚糖对游离抗体和抗原抗体复合物分离度的影响，同时对比了不同抗原抗体反应比例的电泳结果和平板凝胶电泳的结果，并对不同比例的复合物峰面积进行了线性拟合，发现其线性相关，线性相关系数约为0.98。最终得到的最佳电泳条件为100mmol/L Tris-HCl pH=9.0；进样条件：0.5psi5s；分离电压：15kV；检测波长：200nm；毛细管：有效长度50cm，75μm内径。该方法的线性范围为9.286μg/ml-154.8μg/ml，近似等于41IU/ml-687IU/ml，线性相关系数为0.99941，最低检出限约为5.4ug/ml，峰面积的RSD为5.693%（n=5），迁移时间RSD为2.84%（n=5）。本章的电泳开发过程为使用能避免基质干扰的毛细管电泳联合高灵敏检测器提供了思路和借鉴。
第四章中初步探索了两种标志物的毛细管电泳联合电容耦合非接触电导检测器的检测方法。使用电泳条件为400mmol/L乙酸溶液，pH=2.62；进样：20mbar10s；分离电压：15kV；UV检测波长：415nm；C4D激发电压和频率：1200kHz40%vpp检测血红蛋白。通过对比紫外检测器和电导检测器的结果，血红蛋白在电导检测器中的信号峰被确认。使用电泳条件为20mmol/LNaH2PO4溶液，pH=5.0(用NaOH调节pH)；进样条件：20mbar10s；分离电压：15kV；C4D激发电压和频率：600kHz60%vpp；毛细管有效长度45.8cm，75μm内径来检测β-hCG的抗体。通过改变抗体浓度，确认了其在电导检测器中的信号峰位置。本章节的结果证明了毛细管电泳结合非接触电导检测器检测这两种标志物的可行性。
第五章为本课题的结论与展望。