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目的:克隆人Ⅰ型醇脱氢酶(ADH)等位基因的编码区序列,为构建Ⅰ型ADH单个等位基因的真核表达系统做准备。利用生物信息学技术区分Ⅰ型ADH基因的不同等位基因并分析其单核苷酸多态性。
方法:根据从GenBank数据库中检索到的ADH1B基因cDNA的RefSeq序列,用PRIMER5软件在编码区两侧设计一对引物,其中上游引物中有一起始密码子并在5端加上一个XbaⅠ限制性酶切位点,下游引物中有一终止密码子并在5端加上一个EcoRⅠ限制性酶切位点,使扩增产物包含完整编码区序列。取人癌旁正常肝组织,用TRIzol试剂盒提取总RNA后,利用两步法RT-PCR先获得Ⅰ型ADH等位基因的cDNA,然后PCR扩增出大量的Ⅰ型ADH等位基因编码区序列。再用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经过蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析进行鉴定,另外还用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库分析克隆到的Ⅰ型ADH等位基因的单核苷酸多态性。
结果:①用RT-PCR方法扩增出与预期大小相符的ADH基因片段;②经蓝白筛选获得了带pUC19-ADH重组质粒的白色菌落;③用限制性酶谱分析表明所克隆片段与预期的ADH基因编码区大小相符;④DNA测序后的克隆序列编码区与GenBank数据库中Ⅰ型ADH三个基因cDNA的RefSeq序列编码区用BLAST进行两序列比对分析,结果表明送测的几个重组质粒中,成功克隆了Ⅰ型ADH基因中的ADH1C*1,ADH1C*2和ADH1B*2三个等位基因;⑤用BLAST两序列比对分析表明,ADH1C*1等位基因与ADH1CcDNA的RefSeq序列有2个碱基不一致,而其编码的氨基酸序列完全一致,并且克隆序列所编码氨基酸序列的第272位是精氨酸,第350位是异亮氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为ADH1C*1等位基因。用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,确定两个不一致的碱基都是同义单核苷酸多态性。⑥用BLAST两序列比对分析表明,ADH1C*2等位基因与ADH1CcDNA的RefSeq序列有6个碱基不一致,而其编码的氨基酸序列有3个氨基酸不一致,并且克隆序列所编码氨基酸序列的第272位是谷氨酰胺,第350位是缬氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为ADH1C*2等位基因。用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,确定有3个不一致的碱基是同义单核苷酸多态性,而另外3个不一致的碱基是非同义单核苷酸多态性,特别是第272位密码子的第二位碱基和第350位密码子的第一位碱基的这种非同义单核苷酸多态性是区分ADH1C*1和ADH1C*2两个等位基因的依据;⑦用BLAST两序列比对分析表明,ADH1B*2等位基因与ADH1BcDNA的RefSeq序列有2个碱基不一致,而其编码的氨基酸序列有1个氨基酸不一致,并且克隆序列所编码氨基酸序列的第48位是组氨酸,第370位是精氨酸。根据以上分析可确定本克隆序列为ADH1B*2等位基因。用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,确定其中1个不一致的碱基是同义单核苷酸多态性。而另一碱基的不一致目前并未查到其属于单核苷酸多态性。这种碱基变化使克隆的ADH1B*2等位基因第23位密码子代表的是脯氨酸,而RefSeq相应位置代表的是丝氨酸。推测其可能是PCR反应产生的突变,也可能是一种新的非同义单核苷酸多态性,这需要通过进一步的实验证实。
结论:本研究用常规的基因克隆技术和新的生物信息学方法,证实所克隆片段为ADH1C*1,ADH1C*2和ADH1B*2三个等位基因完整的编码区序列,并构建了pUC19-ADH1C*1,pUC19-ADH1C*2和pUC19-ADH1B*2三个重组质粒。由于克隆序列两端分别加上了一个XbaⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位点,可以定向克隆到适当的真核细胞表达载体中,进一步探循其分子作用机制。序列分析证实ADH1C和ADH1B两个基因的核苷酸序列和氨基酸序列都很相似,特别是编码区两侧碱基序列完全一致,因此用一对引物克隆了两个基因的等位基因。另外,通过SNP分析证实ADH1C和ADH1B两个基因的部分碱基位点存在着单核苷酸多态性。