【摘 要】
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研究背景和研究目的脂滴是一种保守的细胞器,其结构为磷脂单分子层包裹着中性脂质,在表面还有多种蛋白质。脂滴有很多功能,如调节脂质、调节自噬和维持内质网与内膜稳态等。因此,其数量变化对细胞有重要影响。脂滴的数量受多种途径调节,其中脂滴的生成和降解尤为重要。脂滴的生成在内质网进行,而脂滴的降解与细胞自噬有关。自噬是细胞中保守的过程,自噬涉及复杂的机制和多种蛋白参与。脂滴的降解和自噬有关,靶向脂质的自噬被
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研究背景和研究目的脂滴是一种保守的细胞器,其结构为磷脂单分子层包裹着中性脂质,在表面还有多种蛋白质。脂滴有很多功能,如调节脂质、调节自噬和维持内质网与内膜稳态等。因此,其数量变化对细胞有重要影响。脂滴的数量受多种途径调节,其中脂滴的生成和降解尤为重要。脂滴的生成在内质网进行,而脂滴的降解与细胞自噬有关。自噬是细胞中保守的过程,自噬涉及复杂的机制和多种蛋白参与。脂滴的降解和自噬有关,靶向脂质的自噬被研究者定义为脂自噬。血管内皮细胞自噬主要就是通过mTOR1调节。研究初期,我们对具有不同细胞器靶向性的化学小分子进行了批量筛选,发现了一种能够促进血管内皮细胞中脂滴数量积累的脂滴靶向型化学小分子HCP1。我们前期实验也发现了 HCP1选择性抑制Grp94的活性,且Grp94的选择性抑制剂可以结合到与ATP结合口袋相邻的两个特定位点:位点2和位点3,而HCP1通过与Grp94中的位点3结合发挥作用。因此,在本研究中我们拟利用小分子化合物HCP1为主要的分子工具,旨在探究HCP1促进细胞中脂滴积累的分子机制。研究内容1.化合物HCP1的脂滴靶向性鉴定;2.检测血管内皮细胞中脂滴的水平变化以检验化合物HCP1对于脂滴数量变化的影响;3.检测化合物HCP1促进血管内皮细胞脂滴积累过程中,脂滴生成和脂滴降解所发挥的作用;4.检测化合物HCP1处理后细胞中自噬相关蛋白水平的变化;5.检测化合物HCP1处理后对U87细胞脂自噬的影响;6.探究化合物HCP1抑制细胞脂自噬的分子机制;7.探究化合物HCP1是否通过抑制Grp94来调控细胞自噬以及调控脂滴的积累。研究方法1.共定位实验;2.脂滴计数实验;3.免疫印迹实验;4.细胞转染实验;5.免疫荧光实验;6.质粒干扰实验实验结果1.在HUVEC、A549细胞、L02细胞和HepG2细胞中,化合物HCP1与脂滴共定位,其中在HUVEC细胞,HCP1有最好的脂滴靶向性;2.化合物HCP1（0.1,1,2,5 μ M）处理HUVEC 24小时后,可以显著促进细胞中脂滴的数量积累,这种促进作用是浓度依赖的;3.在HUVEC中,脂滴的降解途径被阻断时HCP1不能再增加细胞中的脂滴数量,而脂滴的生成途径被阻断时,HCP1依然可以促进细胞中脂滴数量的积累,即HCP1促进脂滴数量增加与脂滴的降解相关,与脂滴的生成无关;4.HCP1可以增加HUVEC中LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平,促进U87细胞中LC3和脂滴的共定位,增加HUVEC中PLIN2的蛋白水平,降低PLIN2的磷酸化水平,即HCP1通过抑制细胞的脂自噬促进细胞中脂滴的积累;5.HCP1可以降低HUVEC中AMPK的磷酸化水平,增加mTORC1的磷酸化水平,而当AMPK被AICAR激活后,HCP1不再对细胞的自噬和脂自噬产生影响,即HCP1通过影响AMPK调节细胞的脂自噬进而调节脂滴数量;6.在HUVEC中Grp94与脂滴共定位,当Grp94被敲低后,脂滴的数量不能再增加,在转染了 Grp94突变型质粒的细胞中,HCP1不再对细胞的自噬和脂自噬产生影响,即HCP1通过抑制Grp94抑制细胞的脂自噬进而调节脂滴数量。
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