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目的:肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn）是一种临床常见的革兰氏阳性条件致病菌,是引起儿童及婴幼儿死亡的首要病原;荚膜多糖（Capsule,CPS）是其的主要毒力因子,在S.pn的定植、粘附、抗吞噬和侵袭性致病中发挥重要作用;S.pn可通过调控CPS的表达量来适应宿主不同的微环境,提高其生存力和致病性。CPS的合成相关基因位于染色体的dex B和ali A基因之间,构成一个完整转录单位—cps操纵子,CPS的合成受cps操纵子的调控。本课题组前期研究显示,cps操纵子的启动区域发生点突变,可显著影响CPS的形成,甚至引起CPS缺失。然而,目前尚不清楚S.pn的cps操纵子上游启动区域受哪些转录因子调控。我们以cps启动子区域作为研究对象,利用DNA-pulldown技术、MALDI-TOF-MS技术、EMSA和缺陷菌方法筛选和鉴定cps操纵子的转录因子,并深入探讨转录调控因子ComE对S.pn的CPS的负向调控作用,为揭示肺炎链球菌CPS的转录调节和致病机制提供实验依据。方法:cps启动子区域转录因子的筛选:DNA-pull down磁珠亲和层析法结合MALDI-TOF-MS以及EMSA筛选和鉴定cps启动子区域结合蛋白;LFH-PCR方法构建结合蛋白因子的缺陷菌,荧光定量PCR检测缺陷菌的cps2A转录水平变化,初步确定cps启动子的转录因子;利用p EVP3质粒构建D39的cps启动子的β-半乳糖苷酶活性报告菌和相应结合蛋白因子缺陷菌,通过评估β-半乳糖苷酶活性变化,进一步验证cps启动子的转录因子。ComE对cps基因座负向转录调控研究:LFH-PCR方法构建D39Δcom E,通过荚膜肿胀实验、荚膜免疫荧光染色以及透射电镜观察D3-WT和D39Δcom E荚膜变化。ComE模拟磷酸化证实ComED58E与cps启动子区域有特异结合能力。利用p JWV25质粒构建D39Δcom E的com ED58E异位回补菌和过表达菌,荧光定量PCR检测异位回补菌和过表达菌的cps2A的转录水平和Western blot及ELISA方法检测异位回补菌和过表达菌的CPS表达水平,证实ComE对CPS的负向调控作用。利用p AE03质粒构建cps启动子的GFP报告菌,通过CSP1诱导实验,进一步证实CSP-Com D/E感受态系统对感受态D39的CPS具有负向调控作用。通过LFH-PCR构建D39Δcom D,证实ComE对CPS的负向调控需要被磷酸化。通过Western-blot和ELISA检测不同葡萄糖浓度和温度培养条件下D39-WT和D39Δcom E的ComE以及CPS的表达,探讨葡萄糖浓度及环境温度对D39的CPS调控的影响。通过小鼠鼻腔呼吸道的粘附和定植实验以及小鼠肺炎和菌血症攻毒模型,证实D39Δcom E的粘附定植能力下降和毒力增强。通过探针截短的EMSA方法,确定ComEp与CPS的结合位点区域;最后构建无标记的ComEp结合位点区域缺陷菌,比较结合位点缺陷细菌与野生菌的转化率,证实ComE对CPS的负向调控有助于细菌转化。结果 DNA pull down磁珠亲和层析法结合MALDI-TOF-MS蛋白质谱分析,获得24个可疑蛋白,从中挑选了可信度较高的8个蛋白（Ccp A、ComE、Gnt R、Tr-act、Mar R、SPD0410、Plc R和HU）作为cps的备选转录因子。通过EMSA分析鉴定出7个蛋白（Ccp A、ComE、Gnt R、Tr-act、Mar R、SPD0410、和HU）与cps启动区有特异性结合,成功构建5个蛋白（ComE、Gnt R、Tr-act、Mar R和SPD0410）的缺陷菌。荧光定量PCR以及β-半乳糖苷酶报告基因方法,筛选出ComE、Gnt R和Tr-act对CPS的转录有明显作用,其中Tr-act对CPS表达有上调作用,ComE和Gnt R对CPS表达都有明显下调作用。双因子缺陷菌的cps2A的荧光定量PCR结果显示,ComE、Gnt R和Tr-act转录因子之间无明显的相互作用。D39Δcom E的荚膜较D39-WT显著增厚:荚膜肿胀实验显示,D39Δcom E的荚膜平均厚度（0.6271±0.1343μm）显著大于野生型D39（0.4678±0.0985μm）;荚膜的免疫荧光染色显示,缺陷型较野生型更容易荧光着色;透射电镜显示,D39Δcom E较野生型D39有更厚的荚膜,其荚膜厚度分别为37.57±0.5214nm和21.43±0.4933nm。荧光定量PCR显示,D39Δcom E较D39-WT的cps2A转录水平升高约44.4%,CPS的表达上调约80%,而D39::com ED58E与D39的cps2A的转录和CPS表达水平无显著性差异。EMSA实验显示,CSP1与CPS启动区无特异性结合,而CSP1诱导实验显示,在0.1OD620nm的感受态条件下,500μg/L的CSP1可诱导D39-p AE03-cps-prom.的ComE表达显著升高,诱导10min后达峰值,升高可达诱导前的3.38倍,而D39-p AE03-cps-prom.经CSP1诱导后GFP的表达被显著抑制,在诱导15min左右达到最大抑制,GFP表达下降达83.8%;这种GFP的抑制与ComE的诱导表达呈负相关,并且有一定的时序性;而D39Δcom E-p AE03-cps-prom.的GFP诱导表达无显著性差异变化。ELISA检测经CSP1诱导的D39-WT和D39Δcom E的ComE和CPS表达量,结果显示经CSP1诱导10min,ComE表达显著升高了120%,而诱导15min后的CPS表达量显著下降了67.1%;D39Δcom E的CPS经诱导无显著变化。Com D缺陷菌实验显示,Com D缺失会影响ComE的磷酸化,从而影响ComE对CPS的转录调节,而体内模拟磷酸化com ED58E异位回补后无论Com D缺失与否,均可显著下调D39Δcom D或D39Δcom E的CPS表达。环境影响因素实验显示,ComE对CPS的调节作用受葡萄糖浓度的影响,ComE在一定浓度范围内随葡萄糖浓度升高而降低,但CPS的表达随葡萄糖浓度升高而升高;D39Δcom E的CPS表达量变化较D39-WT变化明显减弱;温度变化对D39的CPS表达有影响,但对ComE调节CPS的作用影响不显著。小鼠呼吸道的粘附和定植实验显示,D39Δcom E的粘附和定植能力较D39-WT差;小鼠鼻腔和腹腔攻毒实验显示,D39Δcom E的毒力强于D39-WT,这与它们的荚膜变化相一致。通过探针截短的EMSA实验和报告蛋白GFP表达水平检测,确定ComEP与cps启动子区域的结合位点为:TGTCATGTTCTTATTTCATTTTACTATATTTTT;成功构建无标记的ComEP与cps启动子区域的结合位点缺陷菌D39ΔJD3。ELISA结果显示,D39ΔJD3的CPS表达量较D39-WT显著性升高45.8%。比较D39-WT、D39Δcom E,D39Δcom E::com ED58E和D39ΔJD3的转化效率,D39Δcom E几乎没有转化功能,D39Δcom E::com ED58E的转化率是D39-WT的73.9%,而D39ΔJD3的转化率仅是D39-WT的29.6%,这表明ComE对CPS的负向调节影响了感受态细菌的转化。结论 ComE是cps基因座的转录因子,对CPS具有负向转录调控作用,但是ComE需要被磷酸化才具有对CPS的负向调控功能;在一定浓度范围内,葡萄糖浓度变化对ComE介导的CPS调控有影响;ComE介导的CPS负向转录调控增加细菌的粘附和定植能力而降低细菌毒力,在细菌侵袭性感染中具有重要作用;CSP-Com D/E感受态调节系统在细菌感受态形成过程中参与了CPS的负向调控,这种负向调控可促进细菌的转化。