【摘 要】
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目的:挖掘王祖龙教授治疗男性不育症精子DNA损伤的组方规律及核心处方,探讨核心处方作用机制,为中医药治疗男性不育症精子DNA损伤提供理论基础和临床应用依据。方法:本研究分为临床研究和实验研究两部分。1.临床研究方法:收集2021年1月至2021年6月就诊于河南中医药大学第一附属医院王祖龙教授门诊的男性不育症精子DNA损伤患者病历211例,将患者一般信息、症状、证候及完整的中药处方等录入中医传承计算
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目的:挖掘王祖龙教授治疗男性不育症精子DNA损伤的组方规律及核心处方,探讨核心处方作用机制,为中医药治疗男性不育症精子DNA损伤提供理论基础和临床应用依据。方法:本研究分为临床研究和实验研究两部分。1.临床研究方法:收集2021年1月至2021年6月就诊于河南中医药大学第一附属医院王祖龙教授门诊的男性不育症精子DNA损伤患者病历211例,将患者一般信息、症状、证候及完整的中药处方等录入中医传承计算平台（V3.0）系统。通过该系统的统计分析模块对纳入患者处方中药物的四气五味与归经等进行统计;运用该软件方剂分析中关联规则、聚类分析等方法进行组方规律、核心处方等分析。2.实验研究方法:（1）选取45只SPF级雄性ICR小鼠,随机数字法分为空白（Control）组、邻苯二甲酸二乙基乙酯（DEHP）组、邻苯二甲酸二乙基己酯加核心处方高（WFYH）、中（WFYM）、低剂量组（WFYL）,每组9只。将DEHP用玉米油稀释后,DEHP组以及五味扶正益精汤各组均按照1g·kg-1·d-1的浓度诱导精子DNA损伤,同时,WFYH、WFYM、WFYL分别按高、中、低剂量予五味扶正益精汤灌胃,Control组予以同剂量的玉米油和去离子水灌胃,持续8周。末次给药后处死小鼠,分别收集血清、睾丸、精子悬液,检测各组血清促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）、睾酮（T）水平、精子DNA碎片率（DFI）和睾丸组超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量。（2）取小鼠左侧睾丸为样本进行蛋白组学和转录组学联合分析,并采用Western Blot方法对联合分析的差异蛋白进行验证。结果:1.最终收集王祖龙教授治疗男性不育症精子DNA损伤病例211例,对其归纳分析后显示:（1）在该病的辨治中,脾肾两虚证、肾阳不足证、肝肾阴虚证以及肾虚血瘀证较为常见。（2）四气中,运用温性药物最多;五味中,甘味药物使用较多;归经以肾、脾、肝经为主。药物功效中常用的有补虚类、活血化瘀类、利水渗湿类。（3）通过K-means算法与回归模型聚类分析,可提取出王祖龙教授治疗该病的3个核心组合:组合（1）—黄芪、川牛膝、车前子、枸杞子、五味子;组合（2）—枸杞子、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、黄芪、五味子、车前子;组合（3）—当归、五味子、车前子、枸杞子、黄芪。2.经王祖龙教授辨析后,将核心处方命名为“五味扶正益精汤”,并进行动物实验研究:（1）与Control组比较,DEHP组精子DFI明显升高;与DEHP组比较,五味扶正益精汤中、高剂量组小鼠精子DFI均呈不同程度下降（P＜0.05）;（2）与Control组比较,DEHP组血清FSH、LH、T值均呈不同程度下降;与DEHP组比较,五味扶正益精汤中、高剂量组FSH、LH、T均有所升高。（3）与Control组比较,DEHP组MDA、NO升高,SOD降低;与DEHP组比较,WFYM、WFYH组MDA、NO降低（P＜0.05）,WFY各剂量组SOD升高（P＜0.05）。3.选取Control组、WFYM组以及DEHP组小鼠左侧睾丸样本进行转录组学和蛋白质组学联合分析得到:（1）WFY组与DEHP组共同富集于代谢通路（Metabolic pathway,ko01100）、PI3k-Akt信号通路（PI3k-Akt signaling pathway,ko04151）、人乳头瘤病毒感染（Human papillomavirus infection,ko05165）、EB病毒感染（Epstein-Berr virus infection,ko05169）和阿米巴病毒（Amoebiasis,ko05146）。（2）组学联合筛选后得到Aass、Aldh1A7、GSTA3、Bhmt、Svs1、Mug2有差异。4.Western Blot方法验证得到Bhmt蛋白表达与联合组学分析结果一致,且与代谢通路相关（P＜0.05）。结论:1.王祖龙教授以“五味扶正益精汤”为核心处方治疗男性不育症精子DNA损伤,该方与导师提出的精子DNA损伤属于“正虚易感”的学术观点相符。2.DEHP可能通过扰乱雄性小鼠内分泌系统、介导氧化损伤,从而对精子DNA造成损伤。3.五味扶正益精汤能够调节DEHP染毒雄性小鼠内分泌系统,改善雄性小鼠睾丸氧化损伤,促进机体对精子DNA损伤的修复,其机制可能与代谢通路及Bhmt蛋白有关。
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