茶树中Ty1-copia类反转录转座子分子特性的研究

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茶树(Camellia sinensis L.O.Kuntze)是我国主要经济作物之一,由于我国幅员辽阔,气候适宜,尤其是云南等地区适合茶树生长,因此我国茶树品种资源繁多。反转录转座子是最古老的转座元件之一,在基因组的结构,进化中起着十分重要的作用。由于其广泛存在于高等植物基因组中,并且具有高拷贝,高异质性等特点,与植物的抗逆性息息相关,所以成为研究植物基因组时不可或缺的研究部分。反转录转座子中一种重要的类型为Ty1-copia类反转录转座子(copia类反转录转座子)。很多研究表明,在大量的植物中发现了copia类反转录转座子,几乎涵盖所有高等植物的类别。但是,目前在茶树中研究copia类反转录转座子的报道甚少。研究copia类反转录转座子对茶树基因组组成、进化及表达调控有无影响及如何影响,首先需要了解其是否存在于茶树基因组中,以及其序列的变异情况等,而其逆转录酶(RT)序列是反转录转座子中具有转录活性的部分,对其转座起着至关重要的作用。因此本文采用普通PCR技术,对多个国家级茶树良种进行逆转录酶的克隆,拟获得茶树中逆转录酶序列,并分析其结构特征。同时用半定量和实时荧光定量结合的方法研究盐胁迫下茶树品种中逆转录酶的表达情况,并且将胁迫后序列与正常生长序列进行对比,探索反转录转座子的突变和逆境之间的关系。同时采用绝对实时荧光定量的方法检测逆转录酶的拷贝数,利用新的技术手段证明茶树中copia类反转录转座子多拷贝的特性。本论文围绕这些问题展开相关研究,获得的主要研究成果如下:(1)本研究以12种国家级茶树良种基因组为模板,利用简并引物进行PCR扩增克隆,在所有品种中均得到了编码copia类反转录转座子的反转录酶序列,共148条。测序后所得序列长度为260bp左右,经NCBI中BLAST比对结果显示,与已发表的其他物种的copia类反转录转座子逆转录酶序列有很高的相似性。从中选取三个代表品种进行特征分析,经MEGA和DNAstar软件分析表明,均具有逆转录酶的特征保守序列,具有高拷贝,高异质性的特点,各反转录酶序列在碱基同源性、碱基变化上存在较大的差异,经序列特征分析表明碱基替换、移码突变以及终止密码子突变可能是造成茶树反转录转座子异质性的重要原因,这与在其他植物中的研究结果一致。进化树分析显示茶树中反转录转座子可能发生了横向传递和纵向传递。(2)以12个茶树品种中RNA反转录的cDNA序列为模板,检测反转录转座子的活性,结果表明正常生长的茶树品种中copia类反转录转座子存在转座活性。对舒茶早和龙井长叶两个品种进行100mM的盐胁迫处理,生理指标显示茶树在受到盐胁迫后表现出叶绿素荧光指数下降,水分含量下降,植物萎蔫的特征。并以12条逆转录酶引物进行半定量和荧光定量实验,实验结果表明半定量和定量具有一致性。舒茶早在盐胁迫处理1d时,表达量达到最高,为对照的3至6倍,龙井长叶在盐胁迫处理12h时,表达量达到最高,为对照的8-17倍。说明反转录转座子的表达量可以在盐胁迫后24h内提高,能很快响应植物的生长逆境。(3)以舒茶早品种盐胁迫1d后的处理材料的第二叶为模板,提取RNA,并反转录成cDNA,用简并引物克隆其中的逆转录酶序列。将结果用DNAstar软件和Bio Edit软件分析,并与正常生长的植株中逆转录酶序列进行比对后发现,盐胁迫后逆转录酶序列的长度为260bp左右,氨基酸序列具有保守序列的特征,突变程度和异质性高,AT/GC明显高于正常植株。(4)以舒茶早品种基因组为模板,检测其中一条copia类反转录转座子逆转录酶序列RT4的拷贝数,通过制备标准品,计算出舒茶早基因组中RT4基因所对应的copia类反转录转座子的浓度为10-5.71ng/μL。未公布的茶树基因组大小为2.9G,可以计算出每copy基因组中有21.988copies的RT4基因。与梨树中获得的结果进行比较,推测copia类反转录转座子在茶树中具有多拷贝的特点。
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