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鸡胚蛋含有丰富的蛋白质、脂质等营养物质,这对鸡胚的正常生长发育具有重要意义。蛋清和蛋黄蛋白质是鸡胚发育过程中的主要蛋白质来源。蛋白质的功能和结构往往受其翻译后修饰的影响。磷酸化是调节生物功能最常见的翻译后修饰,其可以参与细胞代谢,蛋白活性调控,信号传导等。然而鸡胚蛋孵化过程中存在哪些磷酸化的蛋白质,其磷酸化状态如何变化,这些变化对鸡胚产生哪些影响,目前仍不清楚。此外,蛋清和蛋黄中含有丰富的酶系,孵化可能促使内源酶被激活,从而导致蛋白质在内源酶的酶解下产生一些具有生理活性的多肽,鸡胚发育过程中蛋白质会自动降解形成哪些小分子肽以及这些小分子肽具有什么生物活性,目前鲜有报道。基于此,本研究以孵化第0 d和孵化第12 d的蛋清和蛋黄混合物为原材料,采用比较定量磷酸化组学的策略,利用固定化金属螯合亲和层析特异性富集样品中的磷酸化肽段,并结合纳升液相色谱-串联质谱技术对富集到的磷酸化肽段进行鉴定和定量分析,并选取磷酸化水平发生显著变化的蛋白质,通过进一步的生物信息学分析以及相关文献报道来探讨蛋白质磷酸化状态改变对鸡胚发育的影响。此外,通过MALDI-TOF-MS/MS方法对不同孵化时期蛋清和蛋黄中的小分子多肽进行鉴定,并采用多种生物信息学分析方法对内源肽的功能活性进行评估和筛选,从而为胚蛋源天然活性肽的开发利用提供了数据支撑及理论基础。本研究主要结果如下:(1)采用定量蛋白质组学(串联质谱标签标记)技术对孵化期间第0 d和第12d蛋清和蛋黄蛋白质进行了差异定量磷酸化组学分析。鉴定到100个蛋白上的215个磷酸化位点,其中95个蛋白的203个位点包含定量信息。通过对鉴定到的磷蛋白进行Motif分析,结果表明鸡蛋蛋白质磷酸化的基序是[S-X-E]。(2)差异位点的筛选遵循以下的标准:1.2倍为变化阈值,t-test p-value<0.05。基于以上标准,我们发现在12 d/0 d比较组中有55个磷酸化位点的修饰水平发生上调,68个磷酸化位点的修饰水平发生下调。对这些差异磷酸化的位点进行热图分析表明胚蛋孵化期间蛋白质磷酸化和去磷酸化过程同时发生。如核黄素结合蛋白在孵化过程中磷酸化程度增加,可能促进了该蛋白的跨膜转运,可以及时将核黄素转运到鸡胚。卵黄蛋白原在孵化过程中发生去磷酸化,其作用是为鸡胚提供发育所需的磷,从而促进胚胎骨骼的生长。基因本论分析表明差异变化的磷蛋白主要与结合功能相关。蛋白质互作分析表明磷酸化的蛋白质互作复杂,表明孵化期间磷蛋白发生广泛的相互作用。归一化分析表明孵化期间蛋白质磷酸化状态的改变不受蛋白质丰度变化的影响,即孵化过程中蛋白质自身发生加磷酸基团和去磷酸基团。(3)利用MALDI-TOF-MS/MS研究不同孵化时期(0 d、6 d、14 d、16 d)鸡胚蛋蛋清内源肽组学。在孵化的第0 d、6 d、14 d、16 d分别鉴定到147条,261条,334条,236条肽段。结合已有文献发现,有6条肽段的功能活性已被报道和验证。其中3条肽段(KMKILELPFASGTM、YRGGLEPINF和FRADHPFL)具有抗氧化和ACE抑制活性。1条(GAPVPVDENDEG)具有抗氧化活性。2条(NTDGSTDYGIL、IVSDGDGMNAW)分别具有抗氧化和抗菌功能。对鉴定到的肽段进行生物信息学分析,发现共有13条肽段具有潜在抗氧化活,14条具有潜在ACE制剂活性,9条具有潜在抗菌活性。其中抗氧化肽段主要在孵化早期被鉴定到(0 d和6 d),而ACE抑制肽和抗菌肽主要在孵化后期(14 d和16 d)被鉴定到。这表明在孵化前期肽段主要参与自由基清除,展现抗氧化能力。而后期主要参与血压调节和发挥抗菌作用。通过进一步筛选,3条潜在抗氧化肽(QFGWVLRLGNL、VHGFHRL、VIMGMRF)、1条潜在抗氧化肽(GMNAWVAWR)、3条潜在抗菌肽(LVLKYCPKIGYC、LVLKYCPKIGYCS、CSKTQIWATSHGCK)均无毒性且无致敏性,因此可能具有开发应用价值。(4)利用MALDI-TOF MS/MS研究不同孵化时期(0 d、6 d、12 d、18 d)鸡胚蛋蛋黄内源肽组学。分别在孵化的第0 d、6 d、12 d和18 d分别鉴定到113条、208条、267条、187条肽。4条肽(YINQMPQKSRE、ITMIAPSAF、VTGRFAGHPAAQ和IYEAVNKVSPRAGQ)的功能活性已被报道验证。其中YINQMPQKSRE、ITMIAPSAF、VTGRFAGHPAAQ具有ACE抑制活性。IYEAVNKVSPRAGQ具有抗氧化活性。通过生物信息学分析方法发现14条肽段具有潜在抗氧化活性,9条肽段具有潜在抗癌活性,这些肽段大部分都是在孵化后期(12 d和18 d)被鉴定到。这表明在胚蛋孵化后期,蛋黄可能中存在大量的抗氧化肽和抗癌肽,它们的存在可以清除脂质过氧化产生的自由基以及消除成熟鸡胚患癌的风险。通过进一步筛选,四条潜在抗氧化肽(MGSNAMPRG、MAKAAGAFCILLLLTA、FRKSGFC、SLPFLCQ)和2条潜在抗癌肽(QGVEQGTRKWE、ELTKDLEEVKEKIR)均无致敏性、无毒性,说明这些肽安全性好,具有进一步开发利用的价值。