背景:毛孢子菌是侵袭性感染的重要致病菌,病死率高,预后极差。唑类药物作为治疗侵袭性毛孢子菌感染的最后一道防线,耐药性已经开始发展。本研究旨在调查中国多中心侵袭性感染毛孢子菌的分子流行病学和致病力分布特征及对唑类药物的耐药机制。方法:选取2009年8月至2016年7月CHIF-NET监测网七年间43个监测中心收集的133株侵袭性感染毛孢子菌。利用基因测序分析实现菌种的准确鉴定和基因分型,按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法检测菌株的体外抗真菌药物敏感性,并试验性的建立了我国阿萨希毛孢子菌的流行病学折点（ECV）。同时评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对毛孢子菌的鉴定效能以及Sensititre YeastOne显色药敏板的检测性能。基于体外试验,对毛孢子菌的胞外酶活性分布以及生物膜的形成能力、结构和耐药性展开了调查。联合基因分型,进行聚类分析,寻找致病力分布规律。基于临床分离的多重唑类高度耐药阿萨希毛孢子菌,同时从外排泵活性、唑类耐药相关基因的测序和表达分析以及转录组测序分析,探索阿萨希毛孢子菌的唑类耐药机制。结果:中国多中心侵袭性毛孢子菌感染中,共分离到10个菌种,阿萨希毛孢子菌是主要的致病菌（81.2%）,血液是最常见的标本类型（36.8%）。利用IGS1序列,将108株阿萨希毛孢子菌分为5个型别,基因型1型（41.7%）、4型（31.5%）和3型（23.1%）是我国主要的基因型。体外药物敏感性结果显示,阿萨希毛孢子菌对两性霉素B的MIC值的总体分布高于非阿萨希毛孢子菌,GM值分别是1.36μg/ml和0.7 μg/ml。47.2%的阿萨希毛孢子菌（51/108株）对两性霉素B的MIC值≥2 μg/ml,而全部非阿萨希毛孢子菌（25株）对两性霉素B的MIC值小于1 μg/ml。25%的阿萨希毛孢子菌（27/108株）、2株T.dohaenes、1株星形毛孢子菌、1株粘质毛孢子菌和1株T.faecale对氟康唑呈现较高的MIC值（≥8 μg/ml）。伏立康唑对毛孢子菌呈现出最有效的体外抗真菌活性,GM值为0.09μg/ml。我国阿萨希毛孢子菌对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑的ECV值分别采用16μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml和1μg/ml,而对两性霉素B和5-氟胞嘧啶的ECV值均采用4 μg/ml。总体来看,Bruker Biotyper对非阿萨希毛孢子菌的鉴定效能优于Vitek MS,两种系统的鉴定正确率分别为52%和32%（P=0.152）。Sensititre YeastOne药敏板对阿萨希毛孢子菌药物敏感性的检测能力与微量肉汤稀释法具有较高的一致性。毛孢子菌中至少70%以上的菌株具有DNA酶、溶血酶和酯酶活性,而产生磷脂酶、酪蛋白酶和明胶酶的比例相对较少,分别为54.1%、5.3%和59.4%。阿萨希毛孢子菌中,基因型3型菌株产生溶血酶能力较强,4型菌株分泌酯酶活性较强,而产生明胶酶能力较强的3株菌株均属于基因型1型。血流感染中,阿萨希毛孢子菌具有DNA酶、溶血酶、酪蛋白酶和明胶酶活性的菌株比例均高于非血流感染。本研究中,仅有5株菌株无法形成生物膜,包括4株阿萨希毛孢子菌和1株T.dohaense。阿萨希毛孢子菌中,生物膜形成能力中等以上的菌株百分比高达73.2%,基因型1型中生物膜形成能力弱的菌株比例（40%）高于3型（12%,P=0.015）和4型（11.8%,P=0.005）,具有统计学意义。无论生物膜形成能力的强弱,毛孢子菌的生物膜对4种唑类药物均高度耐药,MBIC50>1024 μg/ml。唑类药物耐药机制方面,临床耐药菌16G1229的外排泵活性明显增高,外源性物质转运ATP酶编码基因A1Q106164和多效性耐药型转运蛋白Pdr11编码基因PDR11,氟康唑诱导下的表达水平显著上调,FPKM值分别为367.94±14.41和339.99±16.9,可能是导致外排泵蛋白活性增加、唑类耐药发生的原因。多效性耐药型转运蛋白Pdr11中S1343T氨基酸置换可能是PDR11过表达的原因。无论是否存在氟康唑压力,ERG11基因的表达水平显著增高,可能在唑类耐药中发挥重要作用。结论:本研究阐明了中国多中心侵袭性感染毛孢子菌的分子流行病学和致病力分布特征,调查了抗真菌药物敏感性分布情况,并试验性建立了我国阿萨希毛孢子菌的流行病学折点。首次发现外排泵编码基因表达上调和EGR11的过表达,可能在阿萨希毛孢子菌的唑类耐药中发挥作用。背景:光滑念珠菌是引起侵袭性念珠菌病常见的致病菌,光滑念珠菌天然对唑类药物的敏感性降低,同时对棘白菌素的耐药性惊人地上升。Gcn5是最具代表性的赖氨酸乙酰转移酶,是真核生物转录调控所必需的物质。本研究旨在通过基因敲除,探讨GCN5对光滑念珠菌抗真菌药物敏感性和致病力的作用以及相应调控基因和通路的动态表达。方法:利用Alt-R CRISPR-Cas9系统,对光滑念珠菌ATCC 2001中的GCN5基因进行敲除和回补。通过（联合）药敏试验和连续稀释生长试验,检测GCN5缺失对光滑念珠菌抗真菌药物和压力物质敏感性的影响。利用时间-杀菌动力试验,观察米卡芬净和氟康唑对gcn5Δ的杀菌和抑菌活性,分析光滑念珠菌的耐药发生频率和功能获得性突变情况。通过Western blot分析,检测GCN5缺失对光滑念珠菌组蛋白乙酰化水平的影响。在转录水平,探索GCN5缺失对光滑念珠菌耐药性和致病力的调控机制。THP-1巨噬细胞感染试验,观察GCN5缺失对光滑念珠菌在巨噬细胞内生存能力的影响。结果:光滑念珠菌敲除GCN5后,对棘白菌素的敏感性增加了 2-4倍,对唑类和SCY048的敏感性增加了 2倍,对FK506（4 μg/ml）+米卡芬净和APX001A的敏感性增加了 8倍以上。GCN5的缺失使棘白菌素耐药相关性FKS突变体对棘白菌素类药物和FK506的耐药性降低了 2-4倍。而联合FK506（4 μg/ml）的作用下,GCN5的缺失完全或接近完全逆转了 Fks介导的棘白菌素耐药性。GCN5的缺失显著增加了米卡芬净和氟康唑对光滑念珠菌的杀菌或抑菌活性。敲除GCN5能够降低光滑念珠菌的耐药发生频率和功能获得性突变。与WT和gcn5Δ::GCN5相比,gcn5Δ菌株H3K9和H3K14的乙酰化水平显著下降,分别约为WT菌株的0.6倍和0.45倍。GCN5调控特定的转录网络,差异表达基因在细胞粘附、细胞膜组分的生物合成、跨膜转运和跨膜转运蛋白活性方面发挥关键作用。光滑念珠菌敲除GCN5后,氟康唑压力下无法驱动跨膜转运蛋白活性、细胞壁组分和外排泵蛋白编码基因的表达。米卡芬净压力下,gcn5Δ需要调动更多的基因来维持生存,差异表达基因主要表现为表达下调,主要与细胞壁生物合成相关。gcn5△对THP细胞的杀伤作用更为敏感,GCN5的缺失显著降低了光滑念珠菌在THP细胞内的生存能力。结论:光滑念珠菌组蛋白乙酰转移酶Gcn5在抗真菌药物的敏感性、压力应激反应和致病机制中发挥关键作用。GCN5的缺失能够降低光滑念珠菌的耐药性和致病力,是潜在的抗真菌药物靶点。本研究为新型抗真菌药物的研发和真菌感染的干预提供新的思路。