[研究背景]骨质疏松症主要特征是骨量减少,骨的微观结构退化：骨小梁变细、断裂、数量减少；皮质骨多孔变薄等。主要临床表现为骨强度下降、脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性疾病。骨质疏松症分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松,绝经后骨质疏松、老年性骨质疏松等属于原发性骨质疏松。而失重性骨质疏松是继发性骨质疏松的一种,目前认为它是由航天失重环境引起的一种特殊的废用性骨质疏松,随着航天事业的蓬勃发展,它已严重的阻碍了人类探索太空的脚步。目前空间飞行采取的运动锻炼、药物预防和营养补充都不能有效防止骨丢失的发生发展；为了确保航天员在未来长期飞行任务中健康、高效工作,需要在细胞分子水平阐明空间骨丢失的发生机制；发展基于细胞分子本质认识的有效对抗防护措施。在航天飞行中宇航员们处于一个完全失重的状态,表现为只有质量而没有重量,我们把这种特殊的力学环境叫做微重力。物体处于微重力环境中时,受到的非引力的力一般都很小,产生的加速度也很小。这种非引力加速度通常只有地面重力加速度的万分之一或更小,其大小通常不超过10-5～1O-4g。为了与正常的重力对比,就把这种微加速度现象叫做“微重力”,微重力越小,失重越完全。失重状态只是理想状态,微重力才是实际情况。失重性骨质疏松就是以力学刺激作用了骨组织导致的骨质疏松。研究发现失重性骨质疏松的骨量丢失的原因主要为骨形成的降低,而骨吸收并没有明显的上升。而成骨细胞的主要作用是感受力学刺激,进而发挥成骨作用,是维持骨量的主要细胞。在失重时成骨细胞的失去正常的代谢规律,他的增殖、分化的功能以及细胞内细胞骨架的聚合与解聚均受到了抑制,这种成骨细胞的数量的变化以及代谢的紊乱就更进一步的降低了成骨细胞的成骨能力,导致骨形成的减少。目前对失重条件下,成骨细胞感受和传导力学刺激的细胞骨架、细胞信号转导及基因表达等发生的变化都取得了一定的进展。目前研究表明胰岛素样生长因子I(IGF-1)的水平与骨质疏松的的发生有密切联系,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是成骨细胞分化调控的重要生长因子,它能减少骨胶原退化、增加骨质沉积、促进成骨细胞分化成熟,其水平与骨密度相关。在骨质疏松的病人中发现血清IGF-1水平降低,而在失重条件下IGF-I信号级联受到抑制。整合素是细胞跨膜分子中的重要一种,细胞通过整合素与聚焦粘附激酶、胞外基质蛋白、细胞骨架蛋白等的相互作用,将感应的力信号转化为化学信号,参与细胞各种生理功能的调节,在机械信号转导中发挥重要作用。在模拟失重的条件下,成骨细胞整合素亚单位的表达是下降的。胰岛素样生长因子系统(IGFS)包括IGF1和IGF2,两个IGF受体,六个IGF结合蛋白(IGFBP1—6), IGFBP蛋白酶。IGFS与成骨细胞和破骨细胞的功能及其成骨破骨偶联有着密切关系。IGF-1是IGFS的重要组成部分。IGF-1是长骨生长的一种必需因子,在干骺端,它刺激软骨细胞的增殖分化,在皮质及松质骨的形成过程中发挥作用,刺激成骨细胞的增殖和分化,增加I型胶原的合成,碱性磷酸酶的活性以及骨钙素的产生。抑制由成骨细胞产生的胶原降解,还对无机盐及肾脏1,25(OH)2D3合成产生作用。IGF-1被认为是肠道吸收及细胞外钙和磷的重要调控剂。最新的研究结果表明,绝经妇女的血中IGF-1含量较成年人低30%～40%,由此可见IGF-1与年龄呈负相关。在青春期前,IGF-1缺乏或呈抵抗可延缓长骨生长及峰值骨量的减低。用双能x线骨密度仪测定去卵巢大鼠的骨质疏松模型的椎、胫骨及胫骨远端骨矿物质密度(BMD)。然后将一种特殊的可持续释放IGF-1的装置放入大鼠皮下6周,结果发现实验所测3个位点的BMD均有一定程度的增加,且呈剂量依赖性。该动物模型由IGF-1引起的BMD的增加,主要是通过骨干增粗来实现的。成骨细胞除具有IGF-1受体外,也具有产生1GF-1的机能。因此IGF-1与骨代谢有着重要的关系。整合素是存在于细胞表面的一种重要跨膜分子,细胞感应细胞外基质中的各种刺激(包括物理,化学等)后,胞外基质蛋白将这种刺激传递给细胞表面的整合素,整合素再通过与细胞骨架蛋白以及细胞内各种酶的反应,将感应到的各种刺激转化为化学信号,从而调节细胞的生理机能,机械信号转导的实现很大程度上也是依赖这一途径进行的。研究证实失重或模拟失重环境下骨骼的机械信号传导途径受到抑制,其中一条重要的途径为细胞外基质-整合素-细胞骨架系统,失重情况下整合素亚单位的表达下降,表明失重可能通过抑制整合素的表达来调节下游分子的变化。研究表明IGF-1和整合素信号通路存在相互联系,失重可能通过整合素影响IGF-1通路的作用。本实验旨在探讨失重条件下IGF-1对成骨细胞整合素亚单位基因表达的影响,为失重性骨质疏松的治疗提供理论和实验依据。[目的]本研究主要从细胞分子水平探讨失重导致骨质疏松的可能机制。以小鼠成骨样细胞株(MC3T3-E1)作对象,以回转器模拟微重力效应,探讨失重条件下IGF-1对成骨细胞整合素亚单位基因表达的影响。以期进一步了解IGF-1及整合素在失重性骨质疏松发生中的相互作用,为骨质疏松的治疗提供新的方法。[对象和方法]1.细胞株及培养利用已建株的小鼠成骨样细胞MC3T3-E1(南方医科大学解剖实验室提供),采用同一批冻存细胞复苏,用低糖的DMEM培养基,10%胎牛血清和双抗作常规培养,4d传代,隔天换液。2.成骨细胞株活性鉴定采用茜素红矿化结节染色法检测体外矿化能力。3.建立模拟失重成骨细胞模型及添加干预使用旋转细胞培养系统(RCCS)中50m1容积的高截面纵横比容器(High Aspect Ratio Vessel, HARV)模拟微重力,并联合Cephodex型微载体进行成骨细胞培养。当成骨细胞株复苏后传至第3代时,在细胞对数生长期,细胞性状较稳定时,更换培养基为无血清的低糖DMEM饥饿培养24h,收集细胞按3×105个细胞/ml随机接种于预先放置微载体的5个回旋培养筒中,分为正常重力组,模拟失重组,模拟失重+10ng/mlIGF-1组,模拟失重+50ng/mlIGF-1组,模拟失重+100ng/mlIGF-1组。正常重力组及模拟失重组灌满无血清的低糖DMEM,其余各组分别灌满含10ng/mlIGF-1、50ng/mlIGF-1、100ng/mlIGF-1的无血清低糖DMEM,排净气泡。正常重力组置于37℃、5%C02、湿度饱和的培养箱中静置培养,其余各组置于回转器上,前8h低速间歇回转,每45min搅动1～2min,之后以30r/min的转速回转培养,每天观察容器内有无气泡产生,如发现气泡,立即在在无菌条件下抽尽气泡,培养48h后消化收集细胞。4.提取RNA进行RT-PCR反应利用Trizol法提取总RNA进行反转录PCR,检测整合素α2α5β1亚单位mRNA的表达,同时以GAPDH基因作为内参照。扫描PCR产物电泳照片,计算integrina2/GAPDH、integrina5/GAPDH、integrinβ1/GAPDH的积分光密度比值,推算integrinα2、integrinα5、integrinβ1基因的相对表达水平。5.统计学方法相同条件的实验重复5次(n=5),实验数据以x±s表示,组间比较利用SPSS19.0统计软件进行单向方差分析(one-way ANOVA)检测各组间差异,LSD方法进行多样本均数两两比较,方差齐性采用Levene检验,显著性检验水准0<0.05。[结果]1.成骨细胞生长情况：MC3T3—E1细胞株经复苏培养后,在相差显微镜下呈三角形、菱形、多边形等不规则形状,细胞透明度好,细胞膜内未见黑色小颗粒。细胞核为较大的圆球形,内含核仁。细胞有2-3个触突,每个细胞的触突均向外伸展,与周围的细胞的突起连接取来,聚集成团形成集落样生长的趋势。2.各组整合素亚单位表达情况：与正常重力组比较,模拟失重组的integriα2、 integrinα5、integrinβ1的mRNA表达明显下降(P<0.05)；与模拟失重组比较,模拟失重+IGF-1组的integrinα2、integrinα5、integrinβ1的mRNA表达明显升高(P<0.05),且呈明显剂量依赖性。[结论]1.MC3T3-E1成骨细胞株具有和原代培养大鼠成骨细胞相同的生物学特性。2.模拟失重状态下,成骨细胞整合素亚单位表达是下降的。3.在模拟失重环境下,胰岛素样生长因子1能增加成骨细胞整合素亚单位表达,且呈明显的剂量依赖性。