骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以低骨密度和骨微结构退化为特征,继而导致骨强度下降和骨折易感性增加的全身性骨骼疾病。基于双能量X射线吸收仪（Dual-energy x-ray absorptiometry,DXA）测量全身或重点部位如髋部（股骨颈和全髋）和脊柱的骨密度（bone mineral density,BMD）,是在世界范围内公认的用于OP诊断、未来骨折风险的预测和动态监测病人的首选方法。已知OP是多因素、多环节的隐匿进程,相关病因学研究主要集中在遗传、内分泌、代谢紊乱及机械性因素等方面,而随着增龄和雌激素缺乏所伴发的慢性低级别炎症状态,介导了多种免疫细胞通过与骨细胞的直接接触或者旁分泌机制,间接参与调控骨重塑。研究表明,外泌体所包裹的microRNA（miRNA）具有充分的生物活性,作为一类细胞间远程通讯的参与者,在OP进展中发挥关键作用。鉴于此,本研究拟从骨免疫学角度,展开包括以下两个方面的研究内容,其一,探究T细胞活化前后外泌体中差异表达的miRNA这一类免疫指标对破骨细胞分化的影响;其二,系统性探索并评估另一类外周血来源的免疫指标与BMD的潜在因果关联。第一章研究目的鉴于多项研究所报道的,异常活化的T淋巴细胞可以分泌多种免疫因子调控破骨细胞的分化从而参与骨重塑进程,我们将目光投向T细胞（Jurkat）活化前后的外泌体,观察对破骨前体细胞分化表型的影响,为后续进一步探讨功能及机制相关实验奠定基础。研究方法本研究拟采用人源T系Jurkat细胞株为模型。获取细胞上清,通过联合超速离心法、膜超滤、沉淀法和膜亲和柱法,进行外泌体的提取,采用透射电镜、Zetasizer Nano ZS分析仪以及Western blot（WB）进行形态学、粒径大小分布和分子表型的鉴定。利用流式细胞术检测T细胞活化标志物CD25和CD69分子的表达并鉴定所建立的Jurkat细胞活化体系。分别提取活化组（AC Jurkat Exos）和非活化组（NCJurkat Exos）的外泌体。两组外泌体用膜蛋白染料PKH67标记后,分别加入破骨前体细胞中进行孵育,观察绿色荧光的表达强弱及定位并确认其可以被破骨前体细胞内吞后,将两组外泌体继续加入靶细胞:人外周血CD14+单核细胞、人单核细胞系 THP-1 细胞、小鼠骨髓单个核细胞（bonemarrow-derived macrophage,BMMs）以及小鼠巨噬细胞系Raw264.7中进行分化诱导培养,用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resis-tant acid phosphatase staining,TRAP）染色、F 肌动蛋白（F-actin）染色观察其对破骨细胞生成的影响。另应用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR）检测在两种常用的鼠源破骨细胞模型中,经NC Jurkat Exos和AC Jurkat Exos处理后,破骨细胞分化相关转录调控因子:原癌基因（proto-oncogene protein,c-FOS）、活化 T-细胞核因子 c1（Nuclear factor of activated T-cells 1,NFATc1）和特异性基因:基质金属蛋白酶9（matrix metallo protein,MMP9）、组织蛋白酶K（cathepsinK,CTSK）和TRAP在mRNA水平的表达情况。研究结果使用透射电镜观察发现,所提取的外泌体呈类圆形囊泡样结构,有典型的茶托样双层膜,粒径大小主要集中在100 nm左右。WB结果显示其表达外泌体特征性蛋白CD9,CD63以及TSG101,物理特性和分子表型均符合外泌体的主要特征。流式细胞术检测结果示,Jurkat活化后CD25和CD69分子的表达均显著升高（P＜0.05）。染色示踪实验结果表明,两组外泌体均可被转运至破骨前体细胞,与NC Jurkat Exos相比,AC Jurkat Exos可以被优先递送至人源和鼠源破骨前体细胞。TRAP染色和F-actin染色结果显示,在4种破骨前体细胞模型中,与空白对照组相比,ACJurkat Exo处理组中,TRAP 阳性的多核破骨细胞数量更多,体积更大,肌动蛋白环的数目显著增多（P＜0.05）;而NC Jurkat Exos组与空白对照组之间,差异无统计学意义（P＞0.05）。此外,qRT-PCR实验结果显示,3组间破骨细胞分化相关基因c-FOS、NFATc1、MMP9、CTSK和TRAP在mRNA水平的表达,也呈现与破骨分化表型类似的变化趋势。研究结论1成功建立了T细胞活化模型并稳定地从细胞上清中分别制备了外泌体NC Jurkat Exos和 AC Jurkat Exos。2 AC Jurkat Exos能促进破骨前体细胞的分化。第二章研究目的基于第一章的结果,进一步筛选并验证两组外泌体间差异表达的miRNA,并聚焦我们所感兴趣的miRNA,研究其对介导AC Jurkat Exos促进破骨前体细胞分化的作用,初步明确其生物学功能。研究方法分别提取NC Jurkat Exos和AC Jurkat Exos中的总RNA,利用高效的microRNA微阵列技术检测两组外泌体中差异表达的miRNA,以及进行文献检索,获取既往研究所报道的,在人原代T淋巴细胞外泌体中富集的miRNA,对芯片筛选所得的部分差异表达的以及总结自文献的miRNA进行RT-PCR验证。选取经过深度验证后的10种miRNA,通过TargetScan等数据库进行靶基因预测并进一步展开基因功能注释（Gene Ontology,GO）及信号通路富集分析（包括 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG和Wiki）。将对应的类似物序列（mimics）分别瞬时转染至RAW264.7和BMMs细胞,通过TRAP染色以及破骨分化相关基因在mRNA 水平的相对定量测定,初步观察其对破骨细胞分化表型的影响。选定hsa-miR-802以及hsa-miR-106a-5p作为进一步研究的对象,分别构建GV647-miR-802、GV647-miR-106a-5p及其阴性对照的重组质粒。经慢病毒包装后进行收集、浓缩和滴度测定,并以最佳条件感染Jurkat细胞,应用qRT-PCR检测细胞水平以及外泌体水平对应的miR-802、miR-106a-5p的表达。在成功建立两组分别过表达miR-802和miR-106a-5p的稳转株后,收集各组稳转株的外泌体分别加入RAW264.7 和 BMMs 中,实验分为以下 3 组:①Jur-GV647-miR-NC-Exo,②Jur-GV647-miR-106-Exo,③Jur-GV647-miR-802-Exo,以CCK8 法、TRAP 染色,F-actin染色以及破骨分化基因在mRNA水平的相对定量测定观察三组外泌体对破骨细胞增殖及分化表型的影响。此外,借助Transwell小室建立稳转株和BMMs非接触式共培养体系,用上述同样的方法,探究其在被外泌体抑制剂GW4869干预后,对破骨细胞分化表型影响的变化趋势。构建并瞬时转染相应的miR-802mimic,miR-106a-5pmimic,抑制剂序列（miR-802 inhibitor,miR-106a-5p inhibitor）以及对应的阴性对照序列（mimic/inhibitor NC）至BMMs。用上述同样的方法分析miR-802以及miR-106a-5p对BMMs细胞活性以及分化的影响。选取与破骨生成密切相关的靶基因,并进一步通过qRT-PCR和双荧光素酶报告基因系统实验验证其与靶基因的互作关系。研究结果miRNA芯片分析结果显示,Jurkat活化前后其外泌体中差异表达的miRNA共有127个,其中上调的共有43个,下调的共有84个。选取表达量发生上调的且人鼠间同源性较高的7个miRNA（FC＞1.1,P＜0.05）以及文献所得的T细胞外泌体高度富集的7个miRNA,经qRT-PCR深度验证发现,与对照组相比,分别各有7个和3个miRNA在AC Jurkat Exos中的表达显著增高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。GO分析结果显示上述miRNA的靶基因主要参与负向调控细胞分化、免疫系统的发育和T细胞的激活等;KEGG和Wiki通路分析的结果表明,其主要富集于磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatidyl-inositol 3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/AKT）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节和T细胞受体信号通路等。在破骨前体细胞过表达10个miRNA后,初步发现,均能不同程度地增强破骨细胞的分化能力。在此基础上,我们选定hsa-miR-802和hsa-miR-106a-5p作为进一步深入研究的对象,成功构建了稳定过表达这2条miRNA的慢病毒稳转株Jur-GV647-miR-802和Jur-GV647-miR-106a-5p,与细胞水平类似的是,外泌体中对应的miR-802/106a-5p表达水平也显著增高（P＜0.05）。与Jur-GV647-miR-NC-Exo处理组相比,Jur-GV647-miR-106a-5p-Exo、Jur-GV647-miR-802-Exo处理组中,破骨细胞的活率均未受到明显影响,此外,破骨细胞的分化能力明显增强。在共培养体系中,加入外泌体抑制剂GW4869预处理稳转株后发现,这一趋势可以被部分逆转（P＜0.05）。在BMMs中分别过表达或抑制这2条miRNA的表达后发现,与阴性对照组相比,细胞活率均不受影响（P＞0.05）,而破骨细胞的分化能力分别受到一定程度的促进或抑制（P＜0.05）。使用在线网站预测可能与miR-802或miR-106a-5p结合的靶基因,分别选取与骨代谢密切相关的靶基因进行实验验证。qRT-PCR结果显示,过表达miR-802后,抑制了对应的靶基因:G蛋白偶联受体-4（Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor-4,LGR4）、肿瘤坏死因子受体相关因子 3（tumor necrosis factor receptor-associated factor 3,TRAF3）、以及 Ras 同源基因家族成员 A（Ras homolog gene family,member A,RHOA）在 mRNA 水平的表达;类似地,过表达miR-106a-5p后,可以抑制对应的靶基因第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）在mRNA水平的表达。双荧光素酶报告基因检测显示,pmirGL-LGR4-3’-UTR-wt、pmirGL-TRAF3-3’-UTR-wt 以及 pmirGL-RHOA-3’-UTR-wt 分别与 miR-802 mimic 共转染后可使荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）,而对应的突变型与miR-802 mimic共转染后荧光素酶活性则无明显变化（P＞0.05）。类似地,pmirGL-PTEN-3’-UTR-wt与miR-106a-5pmimic共转染后,其荧光素酶活性明显降低（P＜0.05）,而突变型的荧光素酶活性不受miR-106a-5p mimic共转染的影响（P＞0.05）。研究结论1初步构建了T细胞活化前后外泌体的miRNA差异表达谱,结合文献搜集的相关miRNA,共筛选出10条上调的miRNA进行富集分析,其可能通过调控多种来自免疫系统的可参与骨代谢的信号通路等方式桥接骨骼系统和免疫系统的相互作用。2源自Jur-GV647-miR-802和Jur-GV647-miR-106a-5p的外泌体可以分别通过增加破骨前体细胞中miR-802和miR-106a-5p的表达来促进其向成熟破骨细胞的分化,且对其细胞活率均没有显著影响。3 miR-802和miR-106a-5p分别通过靶向结合并下调对应的靶基因TRAF3、LGR4、RHOA以及PTEN来介导正向促进破骨分化的进程并参与OP的发生发展。第三章研究目的免疫指标如何与骨骼系统相互作用从而参与OP的发生发展的机制仍未阐明,利用全基因组关联研究（Genome-wide association study,GWAS）分析相关数据,通过孟德尔随机化（Mendelian Randomization,MR）研究方法,系统性地探讨四种免疫指标,包括平均荧光强度（median fluorescence intensities,MFI）,绝对细胞计数（absolute cell counts,AC）,相对细胞计数（relative cell counts,RC）及形态学参数（morphological parameters,MP）与多部位的骨密度（BMD）之间的潜在因果关联,从而为进一步丰富免疫系统对骨代谢稳态的调节作用,为OP的防治提供新线索和思路。研究方法选择并下载来自数据库GWAS Catalog 以及 Genetic Factors for Osteoporosis Consortium（GEFOS）的GWAS数据。采用两样本MR研究方法,以免疫指标为暴露因素,BMD为结局变量,分别筛选和提取与MFI、RC、AC以及MP显著相关的单核苷酸多态性位点（Single nucleotide polymorphism,SNP）（P＜1.00E-5,r2＜0.1）作为工具变量并获取相应信息（效应等位基因,效应值及标准误等）。通过一系列方法,以逆方差加权法（inverse variance weighting,IVW）为主要研究方法,加权中位数法（Weighted Median,WM）、MR-Egger回归法以及MR-PRESSO法（MR pleiotropy residual sum and outlier,MR-PRESSO）作为敏感性分析方法,对免疫指标和BMD的因果关联进行估计。同时利用反向MR分析来避免反向因果关系的影响,并展开多变量MR分析来进一步识别显著的暴露因素是否为OP独立的保护因素或危险因素。最后基于多变量MR框架估计免疫指标与BMD通路中由单核细胞所介导的中介效应,采用系数乘积检验法以及bootstrap重抽样法估算置信区间。研究结果使用遗传变异作为预测因子,我们发现了多种免疫指标与BMD的因果关联达到名义上的显著水平（P＜0.05）。对于MFI指标,与其他免疫细胞组相比,T细胞和B细胞组具有最多数量的免疫指标-BMD关联对（pairs）。其中,最突出的特征是CD40,作为由4个单核细胞亚群均表达的分子,由于其与四个部位的BMD均呈正相关而而备受瞩目。对于AC和RC指标,与BMD具有的因果关联的免疫指标大多来自T细胞组,其中最常观察到的特征是CD39阳性的T细胞亚群。对于MP指标,与BMD关联最显著的免疫指标是SSC-A on CD14+ monocyte。在经错误发现率（false discovery rate,FDR）校正后,我们分别检测到9个MFI-,16个AC-,22个RC-和5个MP-BMD pairs均达到显著水平（q＜0.05）。例如,代表CD4+ Treg细胞的不同激活状态的子集与BMD都具有显著的因果关联并且具有不同的模式。敏感性分析结果表明,我们所鉴定的免疫指标对多效性检测均表现出较好的稳健性。多变量MR分析确认了几种免疫指标（例如CD45RA on CD39+ resting Treg,CD25 on resting Treg和CD33br HLA DR+CD14-AC等）与BMD之间的独立因果效应。中介分析显示单核细胞上的CD40可介导多种免疫指标,特别是CD40 on CD14+CD16-monocyte介导的几种记忆B细胞上的CD27分子与BMD的潜在性关联。研究结论本研究首次系统性评估了外周血免疫指标与OP发病风险的因果关联,这些发现强调了免疫因素在参与调控OP发生发展中其方式的多样性和机制的复杂性。