表面增强拉曼光谱(SERS)是一种强大的振动光谱学技术,能够通过增强金属纳米结构表面化合物的拉曼信号,实现对低浓度分析物的高灵敏检测,并同时提供丰富的分子结构信息。如何将SERS作为一种高灵敏的检测手段已成为分析化学领域研究的热点。在生物医学领域,常常需要对低丰度、短寿命的重要活性分子进行检测,加之生物体系的复杂性进一步加大了对高强度信号输出的需求,因此促发了 SERS传感体系信号放大方法的研究。常用的SERS放大体系如构建新型高活性SERS基底,或利用分析物引发的纳米颗粒组装等,都是基于一个目标物到信号输出的一步转换,因此在提高灵敏度上依旧具有一定局限性。在此背景下,本论文旨在利用本人发现的银离子诱导功能化修饰的金纳米颗粒聚集的现象,将银离子作为放大媒介物,设计目标物引发的多步级联放大策略,构建一个银离子诱导放大(IMCA)SERS传感平台,并将之应用于线粒体DNA、端粒酶、microRNA与外泌体的检测中,系统考察了平台在复杂生化环境中的表现与对于临床实际样品的检测能力。1)银离子诱导放大(IMCA)SERS传感平台的构建本章基于银离子诱导4-氨基苯硫酚(4-ABT)的金纳米颗粒聚集的现象构建了银离子诱导的SERS放大平台。首先制备了构建SERS平台所需部件:通过优化纳米颗粒的合成方法与粒径大小,制备了羟胺还原的直径为60 nm的金纳米颗粒;考察不同报告分子的特性,筛选出既能够与纳米颗粒连接,又能与金属固体表面作用,同时具有高强度SERS信号、峰形清晰明显的化合物4-ABT。然后,使4-ABT与羟胺还原的金纳米颗粒形成SERS标签AuNPs@4-ABT。在此基础上考察了AuNPs@4-ABT对银离子的响应并优化了平台操作条件:探究并初步验证了平台作用机理,考察其选择性、动态范围、灵敏度并优化了报告分子浓度、孵育时间、pH等条件。最后初步考察了平台在复杂环境下的表现。这些工作为本论文后续章节奠定了基础。2)基于IMCA平台与连接酶反应检测线粒体DNA单苷酸多态性本章利用银离子诱导放大SERS平台构建了针对线粒体DNA单苷酸多态性的检测体系。设计上,每一个目标物的识别将产生一个银纳米颗粒(AgNP),而每一个AgNP可以溶解成多个Ag+。大量释放的Ag+可作为放大中间体诱导AuNPs@4-ABT的聚集,从而产生增强的SERS信号。该方法利用了DNA连接酶的高保真度,可以成功地区分人类线粒体DNA中的16189T→C多态性,使之成为除了PCR或质谱测定以外进行SNP检测的另一种替代方案,并且具有高灵敏、易于操作、低成本的特点。更重要的是,通过改变目标捕获单元的设计和AgNPs的组装方式,可以使该方法具有优异的通用性,应用于其他目标物。此工作证明了IMCA平台的适用性,为进一步探索此平台在其他目标物的应用铺设了基石。3)基于多重放大IMCA技术检测组织及单细胞水平的端粒酶活性本章将端粒酶引发的多个AgNPs的装配与IMCA方法耦合,实现了端粒酶的多重放大检测。设计上,有活性的端粒酶可延伸其底物核酸链,从而引发捕获探针杂交和AgNPs组装。单个延伸元件可以触发许多AgNPs的结合,随后AgNPs的溶解可使大量Ag+释放。通过这样的二次放大过程,微量的端粒酶可以触发显著的SERS信号,使检测限达到了单个HeLa细胞。更重要的是,该方法应用于结肠癌患者的组织时也有良好的表现,说明其在基于端粒酶的癌症早期诊断的实际应用中具有很大的潜力。此外,本设计成功地用于测量3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷对端粒酶活性的抑制作用,证明了此方法可用于端粒酶抑制剂和端粒酶靶向药物的筛选。本章工作在前一章一个目标物-一个AgNP-IMCA的基础上,实现了一个目标物-多个AgNPs-IMCA的体系设计,从而进一步提高了放大效率;在实际样品应用上,从细胞层面上升到人体组织层面;在构成材料和操作上,从有酶上升到无酶,降低了方法成本与操作难度。4)基于级联放大IMCA技术检测人血清循环microRNA本章将杂交链式反应(HCR)引入到IMCA平台,进一步提高了目标物诱导组装的AgNPs数量,从而释放更多的Ag+,实现多重级联放大。利用该体系高灵敏度的优势,实现了血清中循环miRNAs的检测,检出限低至0.3 fM。免酶设计对操作的简化,加之两步骤的级联放大的策略,使该方法可用于直接检测慢性淋巴细胞性白血病(CLL)不同阶段患者血清中的循环miRNAs。此体系的设计具有免PCR、无酶、低成本的特点,能够启发相关领域的研究者设计类似工具对血清中多种生物标志物同时进行高灵敏度定量分析,从而为生物医学研究和临床癌症早期诊断提供有价值的信息。5)基于核酸适体与IMCA平台实现体液中外泌体的捕获与检测本章开发了一种可活动的核酸适体功能化微型捕获器,即通过外泌体表面蛋白标志物和核酸适体之间的特异性分子识别来捕获并检测外泌体。此捕获器与IMCA平台耦合,提高了检测灵敏度,检出限可低至167个外泌体/μL,同时该体系延续了IMCA平台简单低耗的特点。并且该体系可对癌症病人血液中提取的外泌体进行分析,而且能直接捕获与检测血清、血浆等生物流体中外泌体,证明了该体系临床应用的潜力。与前三章的工作相比,本工作在检测对象上,从生物大分子(核酸、酶)拓展到了亚细胞器级别的外泌体,扩大了IMCA平台的应用范围;在实际样品应用上,实现了在未纯化的体液中直接检测目标物,推动了 IMCA平台走向实际应用。