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目的：胰腺癌（Pancreatic cancer）是世界范围内最恶性的疾病之一。胰腺癌早期，多数患者无明显症状或体征，直到肿瘤细胞转移到其他器官后发展为晚期才被诊断出来。因此，寻找胰腺癌发生发展、早期诊断及预后相关的新的生物学指标，对于早期发现胰腺癌并改善胰腺癌患者的预后具有重要意义。
随着基因组和转录组测序技术的进步，鉴定出许多新型非蛋白编码转录产物，在这些大量非蛋白质编码转录物中，长链非编码RNA（lncRNA）是一类新型的非蛋白质编码转录物，长度超过200个核苷酸，在多种病理生理过程中具有重要的调节作用。研究发现，TUG1是一种新型的长链非编码RNA，长度为7.1-kb，位于染色体22q12，首次发现被认为是一种新型的视网膜非编码RNA，为各种恶性肿瘤中的关键致癌基因。随着对TUG1研究增多，TUG1在多种肿瘤中被发现，然而目前在胰腺癌中TUG1的研究仍处于起步阶段，在胰腺癌发生发展中作用机制尚不明确，有待进一步阐释。
miR-299-3p是miRNAs的一种，目前国内外文献对其有较少报道。有研究表明，miR-299-3p在骨肉瘤组织中表达下调，与肿瘤细胞增殖、凋亡以及化疗等有关。生物信息学分析显示，TUG1能够吸附调控miR-299-3p的表达，但miR-299-3p在胰腺癌中的具体作用机制还尚不清楚。
本研究首先观察了TUG1和miR-299-3p在人正常胰腺组织、癌旁组织、胰腺癌组织以及胰腺癌细胞系中的表达情况，并分析了TUG1表达与胰腺癌TNM分期的关系，利用Starbase2.0在线预测TUG1与miR-299-3p的关系。其次利用双荧光素酶报告基因实验验证了TUG1能和miR-299-3p结合；并通过MTT、划痕、Transwell、western blot、流式细胞术、ELISA等生物学实验检测TUG1-miR-299-3p对胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3增殖、侵袭、迁移、凋亡、EMT以及Notch1信号通路的影响。进一步运用一系列分子生物学方法探讨TUG1-miR-299-3p在胰腺癌发生发展中相互间调控关系和作用途径，以探索TUG1-miR-299-3p对胰腺癌影响的分子机制。最后建立了胰腺癌小鼠移植瘤模型，进一步研究TUG1-miR-299-3p对胰腺癌移植瘤的影响及机制。本文最终确立了TUG1-miR-299-3p可能通过调控Notch1信号通路来影响胰腺癌细胞的生长、侵袭、迁移、凋亡以及EMT，进而调控胰腺癌肿瘤的生长，这为胰腺癌的治疗提供了新的思路。本研究共分以下三个部分：
第一部分：TUG1和miR-299-3p在胰腺癌中的表达及临床意义研究
方法：1.qRT-PCR技术检测TUG1和miR-299-3p在31例胰腺癌组织和癌旁正常组织样本以及8例正常组织样本中的表达。
2．结合31例胰腺癌组织中TUG1表达水平分析TUG1在胰腺癌组织中的表达与肿瘤的临床特征TNM分期的相关性。
3.qRT-PCR技术检测正常胰腺细胞和胰腺癌细胞株中TUG1和miR-299-3p的表达水平。
4.对TUG1与miR-299-3p在胰腺癌组织中表达关系进行Spearman’s相关分析。
5.利用Starbase2.0在线预测TUG1与miR-299-3p的结合序列。
结果：1.qRT-PCR检测结果显示，与癌旁组织及正常胰腺组织相比，TUG1在胰腺癌组织中显著高表达，miR-299-3p明显低表达。
2.结合31例胰腺癌组织中TUG1表达水平和胰腺癌病人的临床病例资料进行分析，结果发现与Ⅰ+Ⅱ期胰腺癌患者相比，Ⅲ+Ⅳ期胰腺癌患者癌组织中TUG1的表达显著增加。
3.qRT-PCR检测结果发现，相对于正常胰腺导管上皮细胞（HPDE），胰腺癌细胞株PANC-1、PSN-1、BXPC-3、HPAC中TUG1的表达水平均有不同程度的升高，其中PANC-1和BXPC-3细胞中TUG1表达量相对最高。与正常的胰腺细胞相比，PANC-1和BXPC-3细胞中miR-299-3p表达量明显降低。
4.Spearman’s相关分析结果显示胰腺癌组织中TUG1表达与miR-299-3p表达呈负相关。Starbase2.0在线软件预测发现TUG1与miR-299-3p有结合序列。
第二部分：TUG1和miR-299-3p在胰腺癌细胞中的功能研究
方法：1.双荧光素酶报告基因实验验证TUG1和miR-299-3p的关系。
2.构建TUG1干扰、miR-299-3p干扰慢病毒载体。重组慢病毒包装和病毒滴度测定后，病毒颗粒感染胰腺癌细胞系PANC-1、BXPC-3，获得sh-NC、sh-TUG1、sh-TUG1+anti-NC、sh-TUG1+anti-miR-299-3p PANC-1、BXPC-3。并使用qRT-PCR检测TUG1干扰对miR-299-3p表达的影响。
3.MTT法、Transwell、划痕实验实验、流式细胞术、ELISA法和western Blot测定TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3增殖、侵袭、迁移、凋亡、EMT以及Notch1信号通路的影响。
结果：1.双荧光素酶报告基因实验验证TUG1能够和miR-299-3p相互结合。
2.在胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3中，干扰TUG1能够促进miR-299-3p的表达。
3.干扰TUG1能够抑制细胞增殖、侵袭、迁移、EMT和Notch1信号通路的活性，并促进细胞调亡；而同时又下调miR-299-3p能够逆转干扰TUG1对胰腺癌细胞凋亡、增殖、侵袭、迁移、EMT和Notch1信号通路的影响。
第三部分：TUG1和miR-299-3p影响胰腺癌细胞裸鼠成瘤的相关研究
方法：1.通过将sh-NC、sh-TUG1、sh-TUG1+anti-NC、sh-TUG1+anti-miR-299-3p PANC-1细胞进行左腋窝皮下注射，构建PANC-1裸鼠移植瘤动物模型，待荷瘤成功后，每5天测量移植瘤肿瘤体积，30天后，颈椎脱臼处死小鼠，并称量各组小鼠肿瘤重量。
2.qRT-PCR检测各组移植瘤组织中miR-299-3p表达。
3.免疫组织化学法检测TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤组织中Ki67表达影响。
4.Western blot检测TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤组织中EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail，以及Notch1信号通路相关蛋白Notch1、Survivin和CyclinD1表达的影响。
结果：1.相对于对照组，体内干扰TUG1显著抑制移植瘤肿瘤生长，而同时又干扰miR-299-3p则逆转干扰TUG1对移植瘤生长的抑制作用。
2.干扰TUG1显著促进移植瘤肿瘤组织中miR-299-3p的表达。
3.干扰TUG1显著抑制了移植瘤肿瘤组织中Ki67的表达，而TUG1和miR-299-3p同时被干扰后又促进Ki67的表达。
4.在胰腺癌移植瘤中干扰TUG1后E-cadherin表达明显升高，N-cadherin和Snail表达显著降低，而同时又干扰miR-299-3p后E-cadherin表达明显降低，N-cadherin和Snail表达显著升高。
5.与对照组相比，在胰腺癌移植瘤中干扰TUG1后Notch1、Survivin和CyclinD1表达明显降低，而同时又干扰miR-299-3p逆转了TUG1干扰对Notch1、Survivin和CyclinD1表达的影响。
全文结论：
1.在胰腺癌组织和细胞中TUG1明显高表达，而miR-299-3p明显低表达，二者表达呈负相关。TUG1的表达与TNM分期有密切关系。
2.TUG1能够吸附miR-299-3p并抑制miR-299-3p的表达。
3.TUG1-miR-299-3p axis能够通过调控Notch1通路的活性，影响胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、上皮间质转化（EMT）以及调亡。
4.成功构建胰腺癌移植瘤动物模型，TUG1-miR-299-3p axis可以通过促进Notch1通路的活性，促进移植瘤的生长。
5.TUG1发挥促癌的作用，miR-299-3p发挥抑癌的作用，二者可能是潜在的分子治疗靶点。
随着基因组和转录组测序技术的进步，鉴定出许多新型非蛋白编码转录产物，在这些大量非蛋白质编码转录物中，长链非编码RNA（lncRNA）是一类新型的非蛋白质编码转录物，长度超过200个核苷酸，在多种病理生理过程中具有重要的调节作用。研究发现，TUG1是一种新型的长链非编码RNA，长度为7.1-kb，位于染色体22q12，首次发现被认为是一种新型的视网膜非编码RNA，为各种恶性肿瘤中的关键致癌基因。随着对TUG1研究增多，TUG1在多种肿瘤中被发现，然而目前在胰腺癌中TUG1的研究仍处于起步阶段，在胰腺癌发生发展中作用机制尚不明确，有待进一步阐释。
miR-299-3p是miRNAs的一种，目前国内外文献对其有较少报道。有研究表明，miR-299-3p在骨肉瘤组织中表达下调，与肿瘤细胞增殖、凋亡以及化疗等有关。生物信息学分析显示，TUG1能够吸附调控miR-299-3p的表达，但miR-299-3p在胰腺癌中的具体作用机制还尚不清楚。
本研究首先观察了TUG1和miR-299-3p在人正常胰腺组织、癌旁组织、胰腺癌组织以及胰腺癌细胞系中的表达情况，并分析了TUG1表达与胰腺癌TNM分期的关系，利用Starbase2.0在线预测TUG1与miR-299-3p的关系。其次利用双荧光素酶报告基因实验验证了TUG1能和miR-299-3p结合；并通过MTT、划痕、Transwell、western blot、流式细胞术、ELISA等生物学实验检测TUG1-miR-299-3p对胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3增殖、侵袭、迁移、凋亡、EMT以及Notch1信号通路的影响。进一步运用一系列分子生物学方法探讨TUG1-miR-299-3p在胰腺癌发生发展中相互间调控关系和作用途径，以探索TUG1-miR-299-3p对胰腺癌影响的分子机制。最后建立了胰腺癌小鼠移植瘤模型，进一步研究TUG1-miR-299-3p对胰腺癌移植瘤的影响及机制。本文最终确立了TUG1-miR-299-3p可能通过调控Notch1信号通路来影响胰腺癌细胞的生长、侵袭、迁移、凋亡以及EMT，进而调控胰腺癌肿瘤的生长，这为胰腺癌的治疗提供了新的思路。本研究共分以下三个部分：
第一部分：TUG1和miR-299-3p在胰腺癌中的表达及临床意义研究
方法：1.qRT-PCR技术检测TUG1和miR-299-3p在31例胰腺癌组织和癌旁正常组织样本以及8例正常组织样本中的表达。
2．结合31例胰腺癌组织中TUG1表达水平分析TUG1在胰腺癌组织中的表达与肿瘤的临床特征TNM分期的相关性。
3.qRT-PCR技术检测正常胰腺细胞和胰腺癌细胞株中TUG1和miR-299-3p的表达水平。
4.对TUG1与miR-299-3p在胰腺癌组织中表达关系进行Spearman’s相关分析。
5.利用Starbase2.0在线预测TUG1与miR-299-3p的结合序列。
结果：1.qRT-PCR检测结果显示，与癌旁组织及正常胰腺组织相比，TUG1在胰腺癌组织中显著高表达，miR-299-3p明显低表达。
2.结合31例胰腺癌组织中TUG1表达水平和胰腺癌病人的临床病例资料进行分析，结果发现与Ⅰ+Ⅱ期胰腺癌患者相比，Ⅲ+Ⅳ期胰腺癌患者癌组织中TUG1的表达显著增加。
3.qRT-PCR检测结果发现，相对于正常胰腺导管上皮细胞（HPDE），胰腺癌细胞株PANC-1、PSN-1、BXPC-3、HPAC中TUG1的表达水平均有不同程度的升高，其中PANC-1和BXPC-3细胞中TUG1表达量相对最高。与正常的胰腺细胞相比，PANC-1和BXPC-3细胞中miR-299-3p表达量明显降低。
4.Spearman’s相关分析结果显示胰腺癌组织中TUG1表达与miR-299-3p表达呈负相关。Starbase2.0在线软件预测发现TUG1与miR-299-3p有结合序列。
第二部分：TUG1和miR-299-3p在胰腺癌细胞中的功能研究
方法：1.双荧光素酶报告基因实验验证TUG1和miR-299-3p的关系。
2.构建TUG1干扰、miR-299-3p干扰慢病毒载体。重组慢病毒包装和病毒滴度测定后，病毒颗粒感染胰腺癌细胞系PANC-1、BXPC-3，获得sh-NC、sh-TUG1、sh-TUG1+anti-NC、sh-TUG1+anti-miR-299-3p PANC-1、BXPC-3。并使用qRT-PCR检测TUG1干扰对miR-299-3p表达的影响。
3.MTT法、Transwell、划痕实验实验、流式细胞术、ELISA法和western Blot测定TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3增殖、侵袭、迁移、凋亡、EMT以及Notch1信号通路的影响。
结果：1.双荧光素酶报告基因实验验证TUG1能够和miR-299-3p相互结合。
2.在胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3中，干扰TUG1能够促进miR-299-3p的表达。
3.干扰TUG1能够抑制细胞增殖、侵袭、迁移、EMT和Notch1信号通路的活性，并促进细胞调亡；而同时又下调miR-299-3p能够逆转干扰TUG1对胰腺癌细胞凋亡、增殖、侵袭、迁移、EMT和Notch1信号通路的影响。
第三部分：TUG1和miR-299-3p影响胰腺癌细胞裸鼠成瘤的相关研究
方法：1.通过将sh-NC、sh-TUG1、sh-TUG1+anti-NC、sh-TUG1+anti-miR-299-3p PANC-1细胞进行左腋窝皮下注射，构建PANC-1裸鼠移植瘤动物模型，待荷瘤成功后，每5天测量移植瘤肿瘤体积，30天后，颈椎脱臼处死小鼠，并称量各组小鼠肿瘤重量。
2.qRT-PCR检测各组移植瘤组织中miR-299-3p表达。
3.免疫组织化学法检测TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤组织中Ki67表达影响。
4.Western blot检测TUG1-miR-299-3p调控网络对胰腺癌移植瘤组织中EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail，以及Notch1信号通路相关蛋白Notch1、Survivin和CyclinD1表达的影响。
结果：1.相对于对照组，体内干扰TUG1显著抑制移植瘤肿瘤生长，而同时又干扰miR-299-3p则逆转干扰TUG1对移植瘤生长的抑制作用。
2.干扰TUG1显著促进移植瘤肿瘤组织中miR-299-3p的表达。
3.干扰TUG1显著抑制了移植瘤肿瘤组织中Ki67的表达，而TUG1和miR-299-3p同时被干扰后又促进Ki67的表达。
4.在胰腺癌移植瘤中干扰TUG1后E-cadherin表达明显升高，N-cadherin和Snail表达显著降低，而同时又干扰miR-299-3p后E-cadherin表达明显降低，N-cadherin和Snail表达显著升高。
5.与对照组相比，在胰腺癌移植瘤中干扰TUG1后Notch1、Survivin和CyclinD1表达明显降低，而同时又干扰miR-299-3p逆转了TUG1干扰对Notch1、Survivin和CyclinD1表达的影响。
全文结论：
1.在胰腺癌组织和细胞中TUG1明显高表达，而miR-299-3p明显低表达，二者表达呈负相关。TUG1的表达与TNM分期有密切关系。
2.TUG1能够吸附miR-299-3p并抑制miR-299-3p的表达。
3.TUG1-miR-299-3p axis能够通过调控Notch1通路的活性，影响胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、上皮间质转化（EMT）以及调亡。
4.成功构建胰腺癌移植瘤动物模型，TUG1-miR-299-3p axis可以通过促进Notch1通路的活性，促进移植瘤的生长。
5.TUG1发挥促癌的作用，miR-299-3p发挥抑癌的作用，二者可能是潜在的分子治疗靶点。