合成酯类物质对苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的抑菌作用及机制解析

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脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus spp.)是一类嗜酸耐热、产芽孢的革兰氏阳性细菌,其芽孢可以耐巴氏杀菌而存活,污染果汁后会产生愈创木酚等代谢产物,引起果汁口感及风味变差,对果汁加工及出口贸易产生严重影响。因此,本研究以4种合成酯类物质为基础材料,探究其在果汁中的抑菌效果,并对抑菌机制进行初步探究。旨在寻找一种低添加量、安全无毒、可替代传统化学防腐剂的合成类抑菌剂,实现其在果汁中有效抑制脂环酸芽孢杆菌的目标。主要研究内容和结果如下:(1)以天然代谢物ε-聚赖氨酸为对比,通过二倍稀释法测定了对羟基苯甲酸丙酯、单癸酸甘油酯、没食子酸辛酯和尼泊金庚酯对四株愈创木酚产生菌(A.acidoterrestris、A.cycloheptanicus、A.acidiphilus、A.acidocaldarius)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),利用修正Gompertz模型拟合4种酯类物质对脂环酸芽孢杆菌生长曲线的影响。结果表明ε-聚赖氨酸、对羟基苯甲酸丙酯和单癸酸甘油酯的MIC值分别为0.625~1.25、200~400、11.25~22.5 mg/L,没食子酸辛酯和尼泊金庚酯的MIC值均为6.25 mg/L。4株供试菌株中,A.acidoterrestris的耐受性最强,ε-聚赖氨酸和对羟基苯甲酸丙酯对这株菌的杀灭效果最差,MBC值达到了1280 mg/L和3200 mg/L。模型拟合的结果表明测定的MIC值均可在24 h内完全抑制脂环酸芽孢杆菌的生长,且模型拟合的R~2均在0.94以上。(2)以A.acidoterrestris DSM 3922为代表菌株,首先采用电导率仪和蛋白定量试剂盒测定了菌悬液处理后的相对电导率变化及胞内蛋白的泄露情况,其次通过激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察了细胞膜通透性和细胞形态的变化,进一步通过气质联用方法分析了细菌细胞膜脂肪酸成分的变化,最后采用荧光探针测定了胞内ROS的释放和ATP含量的变化,对比探究4种合成酯类物质对DSM 3922可能的抑制机制。结果表明菌悬液的相对电导率在对羟基苯甲酸丙酯和没食子酸辛酯处理24 h后升高了30%~40%,其MBC值的处理使上清液蛋白含量增加至未处理组的1.5~2倍。然而菌悬液在经尼泊金庚酯处理后,相对电导率和蛋白含量变化最小。激光共聚焦显微镜观察结果表明4种酯类物质的处理均不同程度地增加了细胞膜的通透性,扫描电镜的观察结果也证明了细胞形态受到的损害。此外,细菌会通过在细胞膜中增加ω-环状脂肪酸的成分以改变膜的流动性从而适应变化的环境;对羟基苯甲酸丙酯和没食子酸辛酯可能会进一步通过影响ATP合成,限制呼吸作用进行来损伤细菌;单癸酸甘油酯和没食子酸辛酯的处理使胞内ROS释放量达到未处理组的2~2.8倍,这说明两者可能会通过刺激细菌释放大量ROS使细菌造成一定的氧化损伤从而杀死菌体。(3)以稀释浓缩果汁为基质,首先通过测定4种物质在果汁中的MBC以确定其抑菌效果,然后通过比色法、滴定法等测定了处理后苹果汁的常规理化指标,最后通过高效液相色谱和气质联用法测定了苹果汁中可溶性糖、有机酸、单体酚和挥发性风味物质的变化。结果表明对羟基苯甲酸丙酯和尼泊金庚酯对A.acidoterrestris DSM3922的MBC值依旧达到了1600 mg/L和50 mg/L;没食子酸辛酯和单癸酸甘油酯的MBC值分别为0.39~25 mg/L和11.25~45 mg/L,在苹果汁中具有较好的抑菌作用。4种物质的处理使可溶性糖和有机酸含量轻微的降低,但总糖和可滴定酸含量并无显著变化。没食子酸辛酯的加入,较显著地增加了果汁中酚类物质尤其是没食子酸的含量,酯类等挥发性成分也有相应的增加。本研究对比了4种合成酯类物质在果汁中对脂环酸芽孢杆菌的抑菌应用,并探究了其作用机制,没食子酸辛酯和单癸酸甘油酯有潜力作为抑菌剂在食品加工、流通、贮藏过程中应用从而发挥其控制脂环酸芽孢杆菌的作用。
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