【摘 要】
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睾丸组织高表达的基因不仅对生殖细胞的生物学过程非常重要,而且与多种肿瘤的发生密切相关,其中最有代表性的就是癌睾抗原。miRNA和DNA甲基化是调控基因表达的两个主要的表观遗传因素。为了发现睾丸组织高表达基因在miRNA和DNA甲基化方面的表观遗传调控机制,本课题以非梗阻性无精症（Non-obstructive azoospermia,NOA）和梗阻性无精症（Obstructive azoosper
【基金项目】
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睾丸组织高表达的基因不仅对生殖细胞的生物学过程非常重要,而且与多种肿瘤的发生密切相关,其中最有代表性的就是癌睾抗原。miRNA和DNA甲基化是调控基因表达的两个主要的表观遗传因素。为了发现睾丸组织高表达基因在miRNA和DNA甲基化方面的表观遗传调控机制,本课题以非梗阻性无精症（Non-obstructive azoospermia,NOA）和梗阻性无精症（Obstructive azoospermia,NOA）患者的睾丸组织为样本,首先运用基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱芯片筛查了差异表达的基因、miRNA和甲基化位点,然后通过荧光定量PCR技术对芯片结果进行了实验验证,发现两个功能未知的基因PLCXD3和ZCCHC13,它们在生精功能正常的OA睾丸组织中呈强阳性表达,而在精子生成障碍的NOA睾丸组织中未见表达,推测二者对精子生成有重要作用。接着结合生物信息学预测信息,在生殖细胞系和肿瘤细胞系中对着两个基因的靶miRNA,以及ZCCHC13基因的甲基化调控进行了深入研究。本课题的主要研究结果如下:1.建立了 NOA和OA的睾丸组织的基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱,发现OA睾丸组织的基因表达和表观遗传组数据（miRNA和DNA甲基化）与NOA明显不同。2.对差异表达基因和差异表达miRNA进行了关联分析,构建了 miRNA-基因调控网路,软件预测和实验验证结果都证明PLCXD3与miR-34c-3p,ZCCHC13与miR-369-3p有负调控关系。3.在小鼠、OA和NOA的睾丸组织中检测了 PLCXD3和ZCCHC13蛋白定位,首次发现小鼠和OA患者（生精功能正常）的睾丸有PLCXD3和ZCCHC13蛋白的强免疫阳性信号,而在NOA睾丸组织中表达非常弱;正常肝脏组织的PLCXD3和ZCCHC13基因的表达水平都非常低。4.对差异表达基因和差异表达DNA甲基化位点进行了关联分析,发现ZCCHC13基因启动子存在甲基化修饰位点,甲基化转移酶抑制剂诱导的去甲基化能上调其mRNA和蛋白的表达。5.ZCCHC13基因启动子DNA低甲基化修饰是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）组织和细胞系过表达ZCCHC13蛋白的表观遗传原因,而ZCCHC13过表达能激活AKT/ERK/c-MYC信号通路,上调周期蛋白CDK1和CKD4蛋白表达,进而促进肿瘤细胞增殖。综上所述,本课题以睾丸组织为样本建立了芯片联合分析的方法,应用该方法筛选得到了两个关键基因PLCXD3和ZCCHC13,以及分别对应的靶miRNA:miR-34c-3p和miR-369-3p。此外,在生殖细胞和肿瘤细胞中发现ZCCHC13表达水平受DNA甲基化修饰的影响,基因组的去甲基化可以上调ZCCHC13蛋白表达。本研究首次在生殖细胞和肿瘤细胞中揭示了 PLCXD3和ZCCHC13的表观遗传调控方式,为探索无精症和癌症的分子机制提供了重要的实验依据。
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