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目的Twist1属于b HLH(basic helixloop-helix)转录因子家族,是肿瘤上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)一个重要的分子标志。Twist1通过抑制E-cadherin表达诱导上皮性恶性肿瘤EMT过程,使上皮细胞极性改变,细胞间粘附作用减弱,进而增加细胞的迁移能力促使肿瘤发生转移。Twist1高表达与恶性肿瘤转移间的作用机制已明确报道。抗凋亡蛋白家族成员Bcl-2(B-cell lymphoma-2)是细胞内源性凋亡途径的主要调节蛋白,在多种肿瘤中可见Bcl-2高表达,进一步研究显示,Bcl-2还可参与恶性肿瘤的EMT过程,但具体机制尚未可知。本研究的目的在于探索口腔鳞癌中Bcl-2表达与Twist1表达之间的相关性,验证Bcl-2、Twist1间的相互作用机制并探索二者协同作用对调控口腔鳞癌EMT促进肿瘤侵袭转移的影响。方法1.筛选口腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113及Tb3.1为实验对象,氯化钴乏氧处理细胞诱导Bcl-2和Twist1表达,进行Bcl-2、Twist1作用机制研究。应用Real-time实时定量荧光PCR和Western blot实验检测Bcl-2、Twist1表达随乏氧时间增加的变化趋势;蛋白质免疫共沉淀法验证Bcl-2和Twist1的相互作用机制;Lipofectamine2000介导Bcl-2-si RNA,Twist1-si RNA对Tca8113及Tb3.1两个细胞系进行转染处理,核浆蛋白分离法检验敲低Bcl-2、Twist1对Bcl-2/Twist1复合体形成的影响。2.慢病毒系统LV-RFP-sh-Bcl-2,LV-GFP-sh-Twist1感染目的细胞系,单独敲低Bcl-2、Twist1表达或联合敲低Bcl-2/Twist1表达进行细胞功能学实验,运用划痕实验、Transwell实验检测口腔鳞癌细胞迁移、侵袭能力的改变;Western blot实验检测EMT相关蛋白及侵袭相关指标的表达变化;免疫荧光法检测口腔鳞癌细胞EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin表达。3.筛选慢病毒感染并稳定表达的Tca8113口腔鳞癌细胞于裸鼠口底原位注射建立裸鼠荷瘤模型,实验分为4组,空白对照(Control)组,sh-Bcl-2组,sh-Twist1组和sh-Bcl-2/Twist1组。自注射起每3天测量一次肿瘤生长情况,30天后牺牲小鼠进行后续相关实验。解剖小鼠留取口底肿瘤表标本并行小鼠颈部淋巴结清扫,HE染色观察肿瘤细胞形态,鉴别阳性淋巴结;免疫组织化学染色检测小鼠瘤体标本中EMT相关蛋白E‐cadherin、N-cadherin、Vimentin和侵袭相关指标MMP2、MMP9的表达,对体外实验进行进一步验证。结果1.氯化钴乏氧处理口腔鳞癌细胞Tca8113及Tb3.1后,Bcl-2和Twist1表达随乏氧时间延长逐渐升高,出现表达峰值后继而逐步下降,二者表达变化趋势相同。Tca8113细胞乏氧处理12小时出现Bcl-2、Twist1同步表达峰值,Tb3.1细胞中二者表达峰值出现在乏氧24小时后。蛋白质免疫共沉淀结果证实Bcl-2抗体沉降产物中Twist1表达阳性,同样,Twist1抗体沉降产物中Bcl-2阳性表达。核浆分离蛋白Western blot结果显示敲低Twist1或Bcl-2表达,Bcl-2或Twist1胞浆及胞核内表达均减弱;联合敲低Bcl-2/Twist1,表达抑制程度最强。2.Tca8113及Tb3.1口腔鳞癌细胞中转染慢病毒LV-RFP-sh-Bcl-2、LV-GFP-sh-Twist1并筛选稳定表达株。Western blot结果显示单独敲低Bcl-2、Twist1组和Bcl-2/Twist1联合敲低组相比空白对照组的E-cadherin蛋白表达上调,相反N-cadherin、Vimentin表达明显受抑制;侵袭相关指标MMP2、MMP9表达降低。对比Bcl-2/Twist1联合敲低组与单独敲低Bcl-2、Twist1组,联合敲低Bcl-2/Twist1对EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin和侵袭相关蛋白MMP2、MMP9的抑制作用更强。划痕实验结果同样可见处三个理组的划痕闭合速率低于对照组,细胞迁移能力减弱,而Bcl-2/Twist1联合处理组的细胞迁移能力最弱。Traswell实验检测肿瘤细胞侵袭能力改变,对照组穿过matrigel的肿瘤细胞最多,Bcl-2/Twist1联合敲低组穿过的肿瘤细胞数最少。免疫荧光显示N-cadherin表达下调,E-cadherin表达上调,趋势与Western blot显示结果一致。3.肿瘤生长曲线评价敲低Bcl-2、Twist1体内抑瘤作用发现,相比于对照组,低表达Bcl-2、Twist1组均能够抑制小鼠口底原位肿瘤生长,差异具有统计学意义,但敲低Twist1组和Bcl-2/Twist1联合敲低组的体内抑瘤作用比Bcl-2敲低组更为显著,联合敲低组的抑瘤作用最强。HE染色诊断阳性淋巴结报告对照组24枚淋巴结中2枚出现癌转移,其余3个处理组清扫的淋巴结均未见癌转移。免疫组化结果也进一步证实敲低Bcl-2、Twist1表达E-cadherin表达上调,N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9表达下调,肿瘤EMT过程受抑制。结论1.口腔鳞癌细胞中Bcl-2、Twist1共过表达,通过直接相互作用形成Bcl-2/Twist1复合体发挥调节作用。2.Bcl-2、Twist1参与调节口腔鳞癌上皮间质转化过程,在缺氧诱导下直接相互作用形成Bcl-2/Twist1复合体增强对口腔鳞癌上皮间质转化过程的诱导作用,影响口腔鳞癌的侵袭和转移。这可能与乏氧微环境刺激Bcl-2表达上调辅助Twist1入核增加有关。干预口腔鳞癌细胞系中Bcl-2、Twist1的表达水平,肿瘤细胞形态发生变化,细胞表面EMT表征蛋白发生改变,细胞的迁移、侵袭能力减弱。干扰Bcl-2/Twist1表达阻断复合体形成可显著抑制小鼠体内肿瘤生长,降低间质表型相关蛋白表达,一定程度上恢复E-cadherin表达。3.体内动物实验结果与体外实验结果一致,揭示了口腔鳞癌EMT的新调控机制,Bcl-2/Twist1复合体可能作为抗人口腔鳞癌转移新靶点。